王 宇,賈冰晨,吳筱林,張東亮,褚 晶,田曉芹,陳世華,郭善利

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005)

NHX基因編碼Na+(K+)/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,屬于陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Cation/proton antiporter,CPA),能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的Na+(K+)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外或?qū)a+(K+)區(qū)隔化,保證細(xì)胞質(zhì)內(nèi)維持一個(gè)較低的Na+水平,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的pH平衡[1-4].將擬南芥NHX轉(zhuǎn)入番茄中可顯著提高番茄對(duì)鹽害的耐受性[4],NaCl、PEG及ABA脅迫下杜梨PbNHX1的表達(dá)水平顯著上調(diào)[5],過量表達(dá)來自荷花的NnNHX1提高了煙草耐鹽水平[6],過量表達(dá)來自霸王的ZxNHX顯著提高了百脈根葉片和根部Na+、K+和Ca+的積累,并降低細(xì)胞滲透勢,顯著提高了百脈根抗旱和抗鹽能力[7]．這一系列研究結(jié)果表明,NHX在調(diào)節(jié)植物對(duì)應(yīng)答鹽脅迫過程中起到至關(guān)重要的作用．

藜麥(Chenopodiumquinoa.Wild)為莧科藜亞科藜屬的一年生草本植物,原產(chǎn)于安第斯山脈,因?yàn)槠浞N子營養(yǎng)豐富被現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為“營養(yǎng)黃金”[8],藜麥不僅種子營養(yǎng)價(jià)值豐富,而且該植物還具有一系列獨(dú)特優(yōu)異的生物學(xué)特性,例如耐鹽堿、耐貧瘠、抗干旱等．隨著該植物高質(zhì)量參考基因組的發(fā)布[9],藜麥已經(jīng)成為研究植物耐鹽機(jī)制的重要植物材料之一,因此,利用生物信息學(xué)方法對(duì)藜麥CqNHX基因家族進(jìn)行鑒定,全面分析其基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及編碼蛋白的理化性質(zhì)等信息,并研究藜麥CqNHX基因在不同組織及非生物脅迫下的表達(dá)模式,進(jìn)一步認(rèn)識(shí)藜麥耐受鹽脅迫的遺傳分子機(jī)制,為耐鹽藜麥和耐鹽作物遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新等方面提供一定的理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 CqNHX基因家族成員的鑒定和理化性質(zhì)分析

為了鑒定藜麥基因組中CqNHX基因家族,本研究使用含有NHX基因保守蛋白結(jié)構(gòu)域的HMM模 型(PF00999)在藜麥基因組中進(jìn)行搜索,E-value 限定為 1×10-5,并根據(jù)搜索結(jié)果構(gòu)建藜麥特異的NHX的 HMM 模型,根據(jù)新的 HMM 模型對(duì)藜麥基因組進(jìn)行搜索,搜索結(jié)果通過 PFAM 網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/)進(jìn)行驗(yàn)證．藜麥基因組下載自藜麥基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.cbrc.kaust.edu.sa/chenopodiumdb/)．

1.2 NHX基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

下載水稻和擬南芥NHX氨基酸序列,利用 MAFFT 在線網(wǎng)站(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)進(jìn)行聯(lián)配,提取保守部分,然后將這些序列導(dǎo)入 MEGA7.0軟件,選用最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建．所用數(shù)據(jù)分別由以下數(shù)據(jù)庫獲得:擬南芥(https://www.arabidopsis.org/),水稻(http://www.ricedata.cn/index.htm)．使用鑒定出的藜麥NHX氨基酸序列導(dǎo)入在線網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測．

1.3 CqNHX基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

從藜麥參考基因組的基因注釋信息提取鑒定出的CqNHX基因結(jié)構(gòu)信息,導(dǎo)入網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)的在線工具 Gene Structure Dispaly Server(GSDS)進(jìn)行分析,繪制CqNHX的基因結(jié)構(gòu)圖．利用鑒定出的CqNHX基因氨基酸序列使用 MEME 在線網(wǎng)站(http://meme-suite.org/tools/meme)進(jìn)行 motif 的查找和鑒定,保守結(jié)構(gòu)域上限設(shè)置為 10 且允許保守結(jié)構(gòu)域重復(fù)出現(xiàn)．

1.4 CqNHX基因表達(dá)模式分析

藜麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于已經(jīng)報(bào)道的藜麥轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,SRA登錄號(hào)為SRP226463和SRP116149,使用Kallisto[10]計(jì)算表達(dá)水平,使用Excel對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行Log2轉(zhuǎn)換,使用TBtools工具包[11]繪制熱圖,使用Excel繪制柱狀圖．

2 結(jié)果與分析

2.1 CqNHX基因家族的鑒定和理化性質(zhì)分析

使用生物信息學(xué)方法從藜麥基因組中鑒定得到10個(gè)NHX基因家族成員,根據(jù)CqNHX基因與擬南芥AtNHX基因的親緣關(guān)系將其命名為CqNHX1—CqNHX8,CqNHX基因的蛋白質(zhì)長度,等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量等生化屬性如表1所示．其中蛋白長度分布在510～1211個(gè)氨基酸殘基之間,等電點(diǎn)分布在5.38(CqNHX6b)到 9.18(CqNHX3b)之間．

表1 CqNHX基因家族信息及理化性質(zhì)

2.2 CqNHX基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

將擬南芥、水稻和藜麥的NHX氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),使用MEGA7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建．結(jié)果表明:系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹將3個(gè)物種的NHX蛋白聚類為3個(gè)亞組(ClassⅠ、ClassⅡ和Class Ⅲ),ClassⅠ包含14個(gè)NHX基因,ClassⅡ包含2個(gè)藜麥CgNHX基因(CqNHX6a、CqNHX6b)、2個(gè)擬南芥AtNHX基因(AtNHX5、AtNHX6)以及1個(gè)水稻OsNHX基因(OsNHX5);ClassⅢ包含2個(gè)藜麥CqNHX基因(CqNHX7、CqNHX8)和2個(gè)擬南芥AcNHX基因(AtNHX7、AtNHX8)以及水稻OsSOS1基因(圖1)．

利用CBS在線網(wǎng)站對(duì)鑒定出的CqNHX蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測．結(jié)果表明:CqNHX3a和CqNHX3b含有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,CqNHX4a、CqNHX4b和CqNHX7和CqNHX6b含有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,CqNHX6a僅含有9個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,而CqNHX1、CqNHX2、CqNHX7和CqNHX8中均含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,對(duì)擬南芥AtNHX7(AtSOS1)的研究表明,N端密集的跨膜結(jié)構(gòu)具有高度疏水性,而親水性C端結(jié)構(gòu)較長,殘留在細(xì)胞質(zhì)中,而CqNHX7和CqNHX8的跨膜結(jié)構(gòu)域密集的集中在N端,且親水C端結(jié)構(gòu)較長,這與擬南芥AtNHX7的結(jié)構(gòu)類似,表明CqNHX7/CqNHX8可能與AtSOS1具有類似的功能(圖2)．

2.3 CqNHX基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的保守基序

利用MEME 軟件搜索并對(duì)NHX基因家族進(jìn)行保守基序分析,保守基序上限設(shè)置為 10 且允許序列中同一基序重復(fù)出現(xiàn),結(jié)果如圖3,分析結(jié)果表明,CqNHX蛋白中保守基序長度較長,表明CqNHX成員間保守性較高,進(jìn)一步對(duì)這些保守基序在NHX蛋白中的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Class Ⅰ中的基因除CqNHX3a含有9個(gè)保守基序外,其余5個(gè)CqNHX基因的編碼蛋白均含有10個(gè)保守基序,而Class Ⅱ和Class Ⅲ中的成員均含有5個(gè)保守基序．

對(duì)CqNHX基因家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明:除CqNHX3a和CqNHX3b不含有非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)外,剩余8個(gè)CqNHX基因結(jié)構(gòu)完整．對(duì)CqNHX基因家族成員進(jìn)行外顯子數(shù)量統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),CqNHX1、CqNHX2、CqNHX3a和CqNHX4b含有14個(gè)外顯子結(jié)構(gòu),是所有CqNHX中外顯子結(jié)構(gòu)最少的,而CqNHX7中外顯子數(shù)量最多,含有24個(gè)(圖4)．

表2 CqNHX蛋白的基序組成

2.4 CqNHX基因表達(dá)模式分析

RNAseq分析結(jié)果表明:ClassⅠ和ClassⅡ的6個(gè)CqNHX基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性,CqNHX1和CqNHX2除在種子外的所有組織中均檢測到了表達(dá),而CqNHX3a和CqNHX3b只特異性的在種子中表達(dá)(圖5(a));CqNHX1和CqNHX2在藜麥地上部分組織中的表達(dá)受到干旱和高溫的脅迫顯著上調(diào)(圖5(b)),而在根中這2個(gè)基因只受到干旱脅迫的誘導(dǎo)部分上調(diào),對(duì)高溫的響應(yīng)不明顯(圖5(c));CqNHX3a和CqNHX3b在地上和地下部分組織中幾乎檢測不到,這與圖5(a)展示的結(jié)果一致;CqNHX4a、CqNHX4b、CqNHX6a、CqNHX6b、CqNHX7和CqNHX8在藜麥地上部分組織中的表達(dá)受到干旱和高溫脅迫顯著下調(diào),而在根中,CqNHX6a和CqNHX6b表達(dá)水平的變化不顯著,CqNHX4a、CqNHX4b、CqNHX7和CqNHX8的表達(dá)水平只在干旱條件下有一定程度的上升,在高溫脅迫下這些基因的表達(dá)水平幾乎沒有變化．

3 討 論

隨著研究的不斷深入,大多數(shù)物種的NHX基因家族均被鑒定出來,例如玉米[12]、水稻[13]、大豆[14]、番茄[15]和小麥[16]中NHX基因家族均得到了鑒定和系統(tǒng)分析．本研究對(duì)藜麥、擬南芥和水稻NHX蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系分析表明,藜麥CqNHX7和CqNHX8與擬南芥AtNHX7(AtSOS1)和AtNHX8以及OsSOS1被聚到同一個(gè)分支,這表明CqNHX7、CqNHX8可能與AtSOS具有類似的功能并定位于細(xì)胞質(zhì)膜上;系統(tǒng)進(jìn)化分析中藜麥NHX基因與擬南芥NHX在進(jìn)化距離上較水稻NHX更近,這可能與藜麥和擬南芥同屬于雙子葉植物,而水稻屬于單子葉植物有關(guān)．對(duì)藜麥CqNHX蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測表明:CqNHX1、CqNHX2、CqNHX7和CqNHX8中均含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,其中CqNHX7和CqNHX8蛋白在N端存在多次跨膜,這提示CqNHX7和CqNHX8可能在SOS信號(hào)途徑[17]中起到重要作用．

植物在應(yīng)對(duì)逆境脅迫的過程中有著多條途徑,但在干旱、鹽、高溫等誘導(dǎo)的抗性方面具有相同或相似的基因作用機(jī)制[17]．本研究對(duì)藜麥NHX基因的組織特異性和脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了探究,結(jié)果表明:CqNHX1、CqNHX2、CqNHX3a和CqNHX3b的表達(dá)具有明顯的組織特異性,CqNHX3a和CqNHX3b特異的在種子中表達(dá),因此CqNHX3a和CqNHX3b可能參與藜麥發(fā)育早期的K+利用和離子穩(wěn)態(tài)過程中的生理過程．在干旱和高溫的脅迫下,藜麥地上和地下部分NHX基因的表達(dá)水平具有較大差異,藜麥地上部分NHX基因?qū)Ω邷剌^為敏感,除CqNHX1和CqNHX2的表達(dá)受到干旱和高溫脅迫顯著上調(diào)外,其余NHX基因均受到高溫和干旱的誘導(dǎo)而下調(diào),這表明CqNHX1和CqNHX2在受到滲透脅迫后維持一個(gè)較高的表達(dá)水平,在Na+(K+)轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中可能發(fā)揮重要作用．綜上所述,本研究對(duì)藜麥NHX基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)的分析,為藜麥的分子育種提供了基因資源,同時(shí)也對(duì)NHX基因家族參與應(yīng)答外界脅迫的分子機(jī)制研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)．