王美靈,黃亞楠,李敏敏,王艷芳,張瀟文,張雷明

(煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),山東 煙臺(tái) 264005)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種病因未明的自身免疫性疾病,關(guān)節(jié)滑膜炎為其主要特征,RA全球患病率為0.5%～1.0%,患病人數(shù)接近500萬. 如何有效防治RA成為亟待解決的公共健康問題[1].目前抗RA藥物有非甾體類抗炎藥(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs),糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GCs),慢作用抗風(fēng)濕藥(Disease modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs)等經(jīng)典藥物,也有以阿達(dá)木單抗(抗TNF-α)、妥珠單抗(IL-6受體拮抗劑)為代表的新型生物藥. 其中NSAIDs和GCs在緩解關(guān)節(jié)腫脹、疼痛方面療效確切,DMARDs可延緩RA病情進(jìn)展. 但這3類藥物長(zhǎng)期使用存在胃潰瘍、骨質(zhì)疏松和免疫抑制等嚴(yán)重不良反應(yīng)[2]. 以單克隆抗體為代表的生物藥能有效抑制RA病情進(jìn)展,但也存在易致機(jī)體感染、價(jià)格昂貴難以普及的缺點(diǎn),而且約有30%的患者臨床治療無效[3].

人參是治療RA的傳統(tǒng)中藥,人參皂苷是人參的主要活性成分,屬于三萜皂苷類化合物[4]. 據(jù)報(bào)道,人參皂苷及其主要活性成分,如人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1(圖1),對(duì)多種急性和慢性炎癥疾病比如膿毒癥、腦缺血、結(jié)腸炎和動(dòng)脈粥樣硬化都有廣泛的保護(hù)作用. 研究表明,Rb1可以減輕LPS所致的大鼠肺損傷及小鼠急性炎癥傷害感受和神經(jīng)炎癥[5-7],還能通過阻斷JNK和p38信號(hào)通路減輕血管緊張素II誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈瘤[8]. 然而,Rb1對(duì)RA的作用尚未見報(bào)道,因此,本研究旨在探討Rb1對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant-induced arthritis,AIA)大鼠的作用及其機(jī)制,為傳統(tǒng)中藥人參的現(xiàn)代應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague-Dawley(SD)大鼠,雄性,體重160～180 g,由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(魯)20140007. 動(dòng)物房溫度23～25 ℃,相對(duì)濕度40%～60%,光照12 h,所有大鼠自由飲食飲水. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已獲得煙臺(tái)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn).

1.2 藥品與試劑

小鼠RAW264.7細(xì)胞(ATCC TIB-71): 中科院上海細(xì)胞庫提供; 人參皂苷Rb1(貨號(hào): GR1080,純度≥98%): 南京廣潤(rùn)生物制品有限公司提供; 地塞米松注射劑(批號(hào): 41753-43-9): 辰欣藥業(yè)股份有限公司提供; 弗氏完全佐劑(FCA,批號(hào): 170334): 美國(guó)Chondrex公司提供; 大鼠TNF-α(H052)、IL-1β(H002)和IL-6(H007)ELISA試劑盒: 南京建成生物工程研究所提供; 小鼠TNF-α(F3602)、和IL-6(F3538)ELISA試劑盒: 上海西唐生物科技有限公司提供; IκBα(sc-74451)、p-IκBα(sc-74451)、p65(sc-71675)和p-p65(sc-52401)抗體: 美國(guó)Santa Cruz公司提供; 其他試劑均屬分析級(jí).

1.3 儀器

YLS-7B足趾容積測(cè)量?jī)x(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司); 酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司); TGL-16G臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠); Western blot 電泳儀、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad公司); 凝膠成像系統(tǒng)(日本GE生物科技公司).

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大鼠AIA模型制備 于大鼠右后足足跖皮內(nèi)注射0.1 mL FCA致炎,對(duì)照組于相同部位注射等量生理鹽水. 造模當(dāng)天設(shè)為第0天[9].

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 第14天,選擇造模成功的大鼠隨機(jī)分組,共分為6組:對(duì)照組、模型組、地塞米松2.5 mg/kg組、Rb1 5 mg/kg組、Rb1 10 mg/kg組和Rb1 20 mg/kg組. 分組完成后,按上述劑量腹腔注射給藥,每天1次,共14 d.

地塞米松是臨床上治療RA的常用藥物,且有研究表明其抗炎作用機(jī)制與NF-κB信號(hào)通路有關(guān),因此本實(shí)驗(yàn)采用地塞米松為陽性對(duì)照.

1.4.3 關(guān)節(jié)炎評(píng)估 在第0、14、17、20、23和27天用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)定大鼠繼發(fā)側(cè)足趾容積,求關(guān)節(jié)腫脹度. 關(guān)節(jié)腫脹度=(致炎后容積-致炎前容積)/致炎前容積×100%. 并按照Wood法以0—4的等級(jí)評(píng)估關(guān)節(jié)炎: 0級(jí): 無紅腫; 1級(jí): 足小趾關(guān)節(jié)紅腫; 2級(jí): 趾關(guān)節(jié)、足跖部均紅腫; 3級(jí): 踝關(guān)節(jié)以下均紅腫; 4級(jí): 包括踝關(guān)節(jié),全部紅腫. 每只大鼠2只后爪的累積得分作為關(guān)節(jié)炎指數(shù)[10].

1.4.4 關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢測(cè) 第28天,將大鼠麻醉后,4%多聚甲醛心臟灌注,然后將其繼發(fā)側(cè)后肢自膝關(guān)節(jié)以上約3 cm處截?cái)?去除皮膚,用4%多聚甲醛溶液固定和5%甲酸脫鈣后進(jìn)行石蠟包埋,切片進(jìn)行HE染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜、軟骨及骨組織病理學(xué)改變,并以0—4的等級(jí)進(jìn)行評(píng)估[11].

1.4.5 血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平檢測(cè) 第28天,將大鼠麻醉后,眼內(nèi)眥取血,靜置30 min后,離心(3 000 r/min,10 min)取血清. 采用ELISA法測(cè)定血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平.

1.4.6 胸腺和脾臟指數(shù)與組織病理學(xué)檢測(cè) 第28 d,麻醉取血后處死大鼠. 迅速取胸腺和脾臟稱重. 胸腺或脾臟指數(shù)=胸腺或脾臟濕重與大鼠體重的比值(mg/g). 然后對(duì)胸腺和脾臟固定、包埋、切片并進(jìn)行HE染色.

1.4.7 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞加入RPMI 1640培養(yǎng)基,將其置于5% CO2,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d.當(dāng)細(xì)胞融合80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代.

1.4.8 細(xì)胞上清NO、TNF-α和IL-6水平檢測(cè) 細(xì)胞以105個(gè)/孔的密度接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后,設(shè)定對(duì)照組、模型組、地塞米松50 nmol/L組及人參皂苷Rb1(25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L)組. 對(duì)照組給予DMSO,模型組給予1 μg/mL的LPS,給藥組各孔中加入1 μg/mL的LPS和不同濃度的地塞米松或人參皂苷Rb1. 培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清液,Griess法檢測(cè)NO水平. 培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞上清液,ELISA法檢測(cè)TNF-α及IL-6水平.

1.4.9 Western blot檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞以2×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后,按上述方法給藥并造模,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h.向細(xì)胞或關(guān)節(jié)滑膜組織中加入RIPA緩沖液,超聲粉碎后,BCA法測(cè)定蛋白濃度. 將等量的蛋白質(zhì)(25 μg)與上樣緩沖液混勻煮沸(95 ℃,5 min)制成蛋白電泳樣品. 10% SDS-PAGE電泳分離蛋白并將蛋白轉(zhuǎn)印(106 V,60 min)至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后,加入一抗 (1∶1 000) 4 °C孵育過夜,TBST洗滌3次,二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h,蛋白條帶洗滌,顯影后,用圖像分析軟件Image J分析蛋白表達(dá)變化.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Rb1對(duì)AIA大鼠繼發(fā)側(cè)足腫脹及關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

造模后第14天,大鼠繼發(fā)側(cè)足腫脹及關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯增大. 與模型組比較,地塞米松,Rb1 10 mg/kg及Rb1 20 mg/kg能顯著抑制足腫脹(圖2(a)). 與模型組比較,地塞米松及Rb1 20 mg/kg顯著減小了關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分(圖2(b)).

2.2 Rb1對(duì)AIA大鼠關(guān)節(jié)組織病理的影響

HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠關(guān)節(jié)可見明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn),滑膜增生,血管翳生成及骨破壞(圖3(a)). 地塞米松,Rb1 10 mg/kg及Rb1 20 mg/kg能顯著減輕以上癥狀(圖3(b)).

2.3 Rb1對(duì)AIA大鼠血清炎癥細(xì)胞因子的影響

ELISA結(jié)果顯示,模型組血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高. 與模型組比較,地塞米松,Rb1 10 mg/kg及Rb1 20 mg/kg能顯著降低上述炎癥因子水平(圖4).

2.4 Rb1對(duì)AIA大鼠免疫器官指數(shù)及組織病理學(xué)的影響

與對(duì)照組比較,模型組脾臟指數(shù)明顯增大.與模型組比較,地塞米松組胸腺及脾臟指數(shù)顯著減小,而Rb1組胸腺及脾臟指數(shù)無明顯變化(圖5(a)、5(b)).

HE染色結(jié)果顯示,模型組脾臟組織白髓增生,淋巴細(xì)胞聚集,胸腺組織真皮髓質(zhì)和淋巴細(xì)胞無清晰界限. 與模型組比較,地塞米松組淋巴小結(jié)顯著減少和萎縮,胸腺組織延髓體積縮小,而Rb1組無明顯病理改變(圖5(c)、5(d)).

2.5 Rb1對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO水平的影響

Griess結(jié)果顯示,LPS刺激后,模型組NO釋放量顯著增加,與模型組比較,地塞米松及Rb1可顯著抑制細(xì)胞NO的產(chǎn)生,且抑制作用呈明顯的濃度依賴性(圖6).

2.6 Rb1對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TNF-α及IL-6水平的影響

ELISA結(jié)果顯示,LPS刺激后,模型組TNF-α及IL-6的分泌明顯增加,與模型組比較,地塞米松及Rb1可顯著抑制細(xì)胞TNF-α(圖7(a))和IL-6(圖7(b))的分泌.

2.7 Rb1對(duì)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組關(guān)節(jié)滑膜p-IκBα及p-p65表達(dá)明顯上調(diào). 與模型組比較,地塞米松及Rb1 20 mg/kg能顯著降低滑膜p-IκBα及p-p65的表達(dá)(圖8(a)、8(b)).

與對(duì)照組比較,模型組經(jīng)LPS刺激后可下調(diào)RAW264.7細(xì)胞中IκBα的表達(dá),與模型組比較,地塞米松及Rb1可顯著上調(diào)IκBα的表達(dá)(圖8(c)).

3 討 論

RA是一種進(jìn)行性、終生性疾病,可將預(yù)期壽命縮短3～20年,發(fā)病機(jī)理復(fù)雜. 目前,RA的治療重點(diǎn)主要是緩解疾病進(jìn)展,減輕癥狀和改善生活質(zhì)量．

AIA模型因其與人類RA組織學(xué)和免疫學(xué)相似而被廣泛用于RA新藥和靶標(biāo)的確定[12]. 根據(jù)先前研究制備了AIA大鼠并給予相應(yīng)藥物治療,結(jié)果顯示,Rb1可顯著減輕大鼠足腫脹,抑制滑膜增生、血管翳生成及骨破壞,降低血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平. 在體外,Rb1還能降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO,TNF-α及IL-6的分泌. 表明Rb1在體內(nèi)外均具有較好的抗炎作用.

GCs長(zhǎng)期使用副作用較多,如免疫抑制、骨質(zhì)疏松和代謝紊亂等,限制了其使用[13]. 因此,我們檢測(cè)了陽性藥地塞米松與Rb1對(duì)AIA大鼠免疫器官的影響. 研究發(fā)現(xiàn),地塞米松顯著抑制大鼠的免疫功能,而Rb1對(duì)大鼠免疫器官指數(shù)及組織病理學(xué)無明顯改變. 因此,與GCs不同,Rb1發(fā)揮抗炎作用的同時(shí)無明顯免疫抑制作用,安全性好.

據(jù)報(bào)道,NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中起重要作用. 正常情況下,NF-κB與抑制劑IκB結(jié)合而在細(xì)胞質(zhì)中失活,在外界刺激下,IκB磷酸化并降解,釋放NF-κB亞基以進(jìn)行核易位并激活包括炎癥因子在內(nèi)的多種響應(yīng)基因[14]．本研究結(jié)果顯示, AIA大鼠滑膜p-IκBα及p-p65水平明顯上調(diào),LPS刺激后細(xì)胞中IκBα的表達(dá)下調(diào),體內(nèi)外均證實(shí)了NF-κB的激活．而Rb1能顯著抑制以上蛋白變化,從而抑制NF-κB的激活.

以上結(jié)果提示,Rb1對(duì)AIA大鼠具有保護(hù)作用,其保護(hù)作用可能是通過抑制關(guān)節(jié)滑膜中NF-κB信號(hào)通路的激活實(shí)現(xiàn)的.