成 云，魏質(zhì)鑫，張 倩，鄒玉鳳，楊 倩，紹維在，楊毅梅

（1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南騰藥制藥股份有限公司，云南騰沖 679100；3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

蠕形螨（follicle mite）又名毛囊蟲，在分類上屬真螨目蠕形螨科（Demodicidae），是一類永久性寄生蟲。蠕形螨發(fā)育的最適溫度為37℃，可通過直接或間接接觸而傳播。寄生于人體的蠕形螨僅兩種，即毛囊蠕形螨（Demodex folliculorum）和皮脂蠕形螨（D.brevis），此兩種蠕形螨發(fā)育、形態(tài)和致病機理基本相似。

蠕形螨致病機理主要有機械性刺激、繼發(fā)細(xì)菌感染和免疫病理作用3類。蠕形螨在皮膚內(nèi)活動時對上皮細(xì)胞和腺細(xì)胞造成機械性破壞。蠕形螨可引起毛囊擴張，上皮變性，當(dāng)寄生蟲體較多時，可引起其寄生的毛囊、皮脂腺角化過度或角化不全，皮脂腺分泌阻塞及真皮層毛細(xì)血管增生等病變，蟲體的機械刺激和其分泌物、代謝物的化學(xué)刺激可引起皮膚組織的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致宿主局部皮膚的非細(xì)菌性炎癥反應(yīng)。此外，蟲體代謝物可引起變態(tài)反應(yīng)，蟲體的進(jìn)出活動攜帶其他病原微生物進(jìn)人毛囊或皮脂腺可致繼發(fā)感染，引起毛囊周圍細(xì)胞浸潤，纖維組織增生。

人體蠕形螨呈世界性分布，國外報告人群感染率為27%～100%，國內(nèi)人群感染率一般在20%以上，最高可達(dá)97.86%。人體蠕形螨對外界環(huán)境抵抗力較強，日常生活中使用的肥皂、化妝品等均對人體蠕形螨不具殺滅作用。近年來，國內(nèi)外蠕形螨的感染率逐漸升高，部分大學(xué)中的學(xué)生感染率可高達(dá)50%〔1-3〕。

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們對生活質(zhì)量的要求提高，越來越重視蠕形螨對面部皮膚的損害，治療的需求日益增加。治療蠕形螨引起的肌膚問題也逐漸成為科學(xué)工作者研究的方向，越來越多的學(xué)者轉(zhuǎn)向了中醫(yī)中藥對面部蠕形螨的作用研究〔4-8〕。本課題組在查閱大量資料基礎(chǔ)上，進(jìn)行了美洲大蠊萃取液對面部蠕形螨作用的觀察與分析研究實驗。

1 材料與方法

1.1實驗材料美洲大蠊萃取液（以下簡稱“萃取液”，云南騰藥制藥股份有限公司提供）；空白基質(zhì)、甘油、蒸餾水。

1.2方法

1.2.1 取材對象 通過咨詢大理大學(xué)下關(guān)校區(qū)臨床醫(yī)學(xué)院、護(hù)理學(xué)院、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院在校學(xué)生150余人，成功招募82名志愿者參與面部是否感染蠕形螨的檢查實驗，采用透明膠帶法得到21名陽性志愿者參與后續(xù)實驗。

1.2.2 取材方法 蠕形螨取材常用方法包括：①透明膠帶粘貼法；②擠壓刮拭法；③擠粘結(jié)合法。本實驗需要多次取材、反復(fù)觀察與分析美洲大蠊萃取液對人體面部蠕形螨作用，因擠壓刮拭法與擠粘結(jié)合法取材標(biāo)本無法保存，且對受試者皮膚有所損傷，故本課題采用了透明膠帶粘貼法自受檢者面部獲取蠕形螨。

1.2.3 確診方法 將透明膠帶平貼于載玻片上，并在膠帶上注明粘貼部位（如：額頭，左頰，右頰，下頜），發(fā)給受檢者，讓受檢者晚上睡覺前用清水洗臉，待干后，把透明膠帶分別粘貼于相應(yīng)部位。囑受檢者晚上睡覺盡量采取仰臥位，避免膠帶脫落而影響檢查結(jié)果。次日早晨取下膠帶后，貼回原載玻片上，所得樣本及時送至實驗室鏡檢，用碳素筆直接在膠帶上圈出螨蟲所在位置，并記錄結(jié)果〔9〕。

1.2.4 “針刺給藥殺螨法”的產(chǎn)生及應(yīng)用 透明膠帶粘貼法獲取螨蟲后，螨蟲緊密粘貼于膠帶上，液態(tài)藥物如何給藥是該實驗的關(guān)鍵，若取下膠帶給藥，蟲體與膠帶將分離，這樣會造成螨蟲破損及遺失，無法判斷藥物效果；由于不易確定螨蟲位置，無法準(zhǔn)確給藥。課題組經(jīng)過反復(fù)試驗摸索，發(fā)現(xiàn)直接用注射器向膠帶下圈內(nèi)給藥，能使藥物與螨蟲充分接觸以發(fā)揮藥物作用，不會造成螨蟲遺失，易再次查找螨蟲位置。因該方法以注射定點殺螨觀察為特點，特取名“針刺給藥殺螨法”。

應(yīng)用“針刺給藥殺螨法”進(jìn)行效果實驗。在顯微鏡下選取活動活躍的蠕形螨24只，隨機分為3組，每組8只。用注射器分別向其中兩組膠帶下加入50%和60%的萃取液，另外一組加蒸餾水作為空白對照組。將加好藥的樣品置于37℃的恒溫箱中，每5 min觀察一次，仔細(xì)觀察蠕形螨的活動情況和死亡情況，并詳細(xì)記錄加藥后蠕形螨的死亡時間和蟲體的變化情況。

1.2.5 “針刺給藥殺螨法”體外實驗 確定不同濃度萃取液對面部蠕形螨的殺傷作用且確定最適殺螨濃度。標(biāo)注蠕形螨透明膠帶玻片標(biāo)本號。隨機平均分為7組，分別記為1組～7組。1組用藥為空白基質(zhì)，2組用藥為1%萃取液，3組用藥為2%萃取液，4組用藥為3%萃取液，5組用藥為4%萃取液，6組用藥為5%萃取液，7組用藥為6%萃取液。分別在低倍顯微鏡下計數(shù)各組玻片活螨成蟲個數(shù)。將上述不同濃度萃取液分別用注射器加到各標(biāo)本膠帶下，使萃取液與蟲體充分接觸，置于37℃恒溫箱中，每隔6 h用顯微鏡觀察螨蟲死亡情況。

1.2.6 感染者面部用藥 根據(jù)“針刺給藥殺螨法”確定的最適濃度，并于試驗前14 d告知受試者（面部蠕形螨檢查陽性志愿者）停用一切口服及外用藥物。每天晨起和晚睡前各用藥1次，用藥前用溫水洗臉、拭干，然后分別滴加萃取液并將其涂于整個感染部位，輕揉片刻。分別于用藥后1、3和7 d用透明膠帶取螨法取螨觀察，分別記錄玻片上所有螨蟲數(shù)及死亡、存活的螨蟲數(shù)。觀察受試者面部感染部位用藥后蠕形螨查蟲數(shù)量的變化以及皮膚的改善情況。

1.3蠕形螨死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)“針刺給藥殺螨法”給藥使螨蟲與萃取液充分接觸，在400×顯微鏡下觀察到蟲體收縮、透明，蟲體螯肢和足停止活動，用解剖針觸之不動，蟲體破裂，外周有油滴樣堆積物。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對資料進(jìn)行分析，采用Pearsonχ2檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1萃取液對面部蠕形螨的殺傷效果分析分別選8只活動明顯的蠕形螨進(jìn)行預(yù)實驗。加藥前高倍鏡觀察蠕形螨，頭、足均有活動。加入50%萃取液10 min后有蠕形螨死亡，35 min后全部死亡；加入60%萃取液15 min后有蠕形螨死亡，35 min后全部死亡。見表1。

表1 “針刺給藥殺螨法”實驗效果觀察

2.2不同濃度萃取液體外實驗殺螨最適濃度的確定萃取液有很好的面部殺螨作用，濃度為6%、3%、2%的萃取液有100.00%殺螨效果，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ26%=8.57、χ23%=13.50、χ22%=14.70，P＜0.05）。由此可見，6%，3%，2%濃度的萃取液殺螨效果較好，考慮到藥物成本，取最小殺螨濃度2%為最適濃度。見表2。

表2 不同濃度萃取液體外實驗效果觀察

2.3受試者用藥后情況分析21名陽性志愿者中，僅有8名愿意參加面部用藥。8名受試者面部感染部位用藥以后，皮膚潮紅的癥狀有不同程度的改善。在用藥3 d后，其中2名受試者面部查蟲出現(xiàn)陰性結(jié)果，4名受試者面部查蟲死亡率明顯降低，1名受試者面部查蟲死亡率明顯升高，1名受試者面部查蟲死亡率不變。用藥7 d后，有4名受試者面部查蟲出現(xiàn)陰性結(jié)果，2名受試者面部查蟲死亡率明顯降低，1名受試者面部查蟲死亡率明顯升高，1名受試者面部查蟲死亡率不變。見表3。

3 討論

當(dāng)前人體蠕形螨感染呈世界性分布且逐年增高。近年來，專家學(xué)者對蠕形螨進(jìn)行的研究主要包括使用化學(xué)合成藥物、天然提取藥物等〔10-12〕。但是這些藥物療效差，或長期使用有一定毒性及對皮膚有刺激性，破壞了皮膚的營養(yǎng)狀況造成對皮膚的損傷。此外，市場上出售的除螨護(hù)膚品中，大多數(shù)添加劑主要集中在金盞花、金縷梅、金銀花、茶樹提取物上，這些植物的提取液主要作用集中在抑菌、控油，僅僅通過抑制油脂分泌達(dá)到防螨、治螨的目的。抑螨途徑單一而且效果不佳，除此之外還破壞了皮膚的營養(yǎng)狀況造成對皮膚的損傷〔12〕。本實驗旨在評估萃取液對蠕形螨的殺傷作用，探索效果最好、副作用最小的殺螨濃度，并能夠應(yīng)用于臨床起到治療作用。

表3 2%萃取液面部殺螨效果觀察［n（%）］

實驗采用透明膠帶粘貼法獲得蠕形螨，此法檢獲率較高，容易鏡下觀察，且不會對受檢者面部皮膚造成影響，于體外實驗時不受濕度和空氣的影響，但是不易給藥，若撕下膠帶給藥，會造成螨蟲的遺失和移位且易損傷蟲體，故本實驗自行設(shè)計了“針刺給藥殺螨法”。在摸索“針刺給藥殺螨法”的過程中，嘗試了多種方法，如將取得標(biāo)本的透明膠帶查蟲后直接撕取然后涂藥，再次顯微鏡下觀察，找不到原來標(biāo)記的相同位置的蠕形螨，且查蟲的難度包括顯微鏡下的清晰程度和尋找難度均變高；透明膠帶扎孔滴加藥物的嘗試中，藥物無法進(jìn)入膠帶和玻片之間，不能與螨蟲接觸，無法觀察藥物效果。在多次反復(fù)試驗后，摸索出“針刺給藥殺螨法”，注射器吸取萃取液，在已經(jīng)標(biāo)記出面部蠕形螨位置的圈邊刺入，針頭朝圈心，緩慢注射藥物，使得藥物浸入整個圈中，進(jìn)入玻片和膠帶之間且使得其與面部蠕形螨充分接觸，并且面部蠕形螨蟲體不發(fā)生較大的移動，便于觀察，以準(zhǔn)確獲取蟲體用藥后的活性數(shù)據(jù)。

預(yù)實驗結(jié)果表明，萃取液有很強的體外殺螨作用，但由于所用萃取液濃度（60%和50%）過高，不宜直接用于面部實驗。參考康復(fù)新液的有效濃度后，逐步探索本藥體外殺螨作用的最適濃度。不同濃度萃取液實驗結(jié)果表明，其中3種濃度的萃取液有100.00%殺螨效果，考慮藥物成本，萃取液的體外作用最適濃度為2%，此濃度比康復(fù)新液的有效濃度低，理論上不會對人體造成損害，故將2%萃取液用于人體面部實驗。

2%萃取液面部殺螨效果觀察，因個體差異，用藥后的情況并不相同。在受試者面部用藥3 d后出現(xiàn)3種不同的狀況，其中4名受試者面部查蟲死亡率明顯降低，這可能是由于萃取液對面部皮膚毛囊深部螨蟲的刺激作用，使之爬出皮膚表面，而使查蟲死亡率明顯降低。用藥7 d后，有4名受試者面部查蟲出現(xiàn)陰性結(jié)果，可能是由于萃取液對這4名受試者殺螨效果明顯，死螨及時被洗掉，同時不排除萃取液對該4名受試者面部蠕形螨無刺激作用或刺激作用還未表現(xiàn)。其中2名受試者經(jīng)過7 d用藥后面部查蟲死亡率明顯降低，推測是因為個體差異藥物對面部蠕形螨的刺激敏感性不同所致。

美洲大蠊具有促進(jìn)組織修復(fù)、改善微循環(huán)、抗炎鎮(zhèn)痛作用〔13〕，用藥7 d后觀察受試者的面部狀況發(fā)現(xiàn)均有不同程度的好轉(zhuǎn)，其中包括毛孔縮小、皮膚彈性增加等。

4 結(jié)論

美洲大蠊萃取液對于面部蠕形螨有較好的殺蟲效果，萃取液對體外蠕形螨作用的最適濃度為2%，效果好，未見副作用，受試者的面部皮膚狀況較用藥前均有不同程度改善。本項目研究過程中通過多次改進(jìn)設(shè)計的“針刺給藥殺螨法”實用有效，為相關(guān)課題的研究提供了簡易可行的新方法。

5 展望

20世紀(jì)70年代以來，我國科學(xué)工作者開始對美洲大蠊進(jìn)行研究，并已取得一定成果?？祻?fù)新液是從昆蟲藥材提取液中分離、精制而成的生物制劑，是根據(jù)云南大理白族人民應(yīng)用美洲大蠊治療惡瘡的有效經(jīng)驗提取而成。經(jīng)美洲大蠊醇提物純化精制而成的生物制品康復(fù)新液治療了大量在越自衛(wèi)反擊戰(zhàn)中受傷的戰(zhàn)士，顯示出其對燒傷、燙傷等外傷刨面的良好療效〔14-16〕。目前尚未見美洲大蠊萃取液針對人體面部蠕形螨作用的相關(guān)報道，本實驗證明用美洲大蠊萃取液治療人體面部蠕形螨感染具有很大的研發(fā)前景。本課題組接受來自云南騰藥制藥股份有限公司的委托，實驗結(jié)果可由實驗室理論研究轉(zhuǎn)化為藥用物品，具有極高的商業(yè)價值和科研轉(zhuǎn)化效益。隨著人們對蠕形螨病的治療需求日益增加，治療蠕形螨引起的肌膚問題也逐漸成為科學(xué)工作者研究的方向，本次試驗為解決面部蠕形螨問題提供了新的方法。

“針刺給藥殺螨法”是本實驗自創(chuàng)方法，操作簡便，在本實驗過程中證實其有效性及可行性，為相關(guān)實驗涉及透明膠帶取材的研究提供新的實驗方法。