楊永壽，何正春，肖培云

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）一直是困擾人類(lèi)的頑疾，癥狀主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)性呼吸困難、干咳等，是以彌漫性的肺泡炎、肺間質(zhì)炎癥和間質(zhì)纖維化為組織學(xué)特點(diǎn)的一組疾病群，至今尚無(wú)可逆轉(zhuǎn)肺纖維化的藥物〔1〕。目前臨床上多選用腎上腺皮質(zhì)激素、干擾素、秋水仙堿等藥物進(jìn)行長(zhǎng)期治療，但這些藥物副作用大，且不能有效阻止肺纖維化的進(jìn)一步發(fā)展〔2〕，一旦染上，終身不愈，最終導(dǎo)致肺部功能喪失，活活憋死，給患者和家屬造成極大的身心困擾和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔3-4〕。因此，尋找能更好治療、延緩肺纖維化病程的藥物和治療方法，最大限度減輕病人痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提高其生活質(zhì)量是目前醫(yī)藥工作者急需研究的課題。

美洲大蠊（Periplaneta americana）為昆蟲(chóng)綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬干燥蟲(chóng)體，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》〔5〕，研究表明美洲大蠊提取物具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用〔6-7〕，過(guò)氧化反應(yīng)能促進(jìn)纖維化性疾病的發(fā)展，故美洲大蠊有望通過(guò)抑制機(jī)體過(guò)氧化反應(yīng)達(dá)到抑制肺纖維化的目的。前期體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊抗肺纖維化活性提取物（ML-HB）能顯著抑制人胚肺成纖維細(xì)胞（HEL）生長(zhǎng)〔8-9〕。本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)博來(lái)霉素（BLM）復(fù)制大鼠肺纖維化模型，研究ML-HB對(duì)BLM致大鼠肺纖維化的干預(yù)作用，為美洲大蠊抗肺纖維化的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g（購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004，批號(hào)：20160911），自由采食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境符合GB 14952—2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》有關(guān)無(wú)特定病原體級(jí)的要求。

1.2試劑注射用鹽酸博來(lái)霉素（以效價(jià)計(jì)15 mg∕支，Bleomycin，BLM，日本化藥株式會(huì)社產(chǎn)品，批號(hào)：Y50512）；ELISA試劑盒（大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α），欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)：R160729-102a；大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1），欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)：R160831-107a）；鼠抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）單克隆抗體（英國(guó)abcam公司）；兔抗Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）多克隆抗體（英國(guó)abcam公司）；戊巴比妥鈉（德國(guó) Sigma公司）；ML-HB（實(shí)驗(yàn)室自制，凍干粉）。

1.3儀器RHYⅢ組織切片機(jī)（江蘇常州中威電子儀器有限公司）；BMJ-Ⅲ組織包埋機(jī)（江蘇常州中威電子儀器有限公司）；PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀（江蘇常州中威電子儀器有限公司）；ASP-300S自動(dòng)脫水機(jī)（德國(guó)Leica公司）；CKX41SF倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；SN255939型連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。

2 方法

2.1分組與給藥隨機(jī)將SD大鼠分為模型組、ML-HB組、正常對(duì)照組，每組40只，造模24 h后腹腔注射給藥，ML-HB組腹腔注射60 mg∕kg的ML-HB溶液，1次∕d（給藥計(jì)量參考前期預(yù)實(shí)驗(yàn)），模型組給等體積的0.9%氯化鈉溶液，正常對(duì)照組正常飼養(yǎng)。

2.2模型制備腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠（0.2 mL∕100 g），仰臥手術(shù)臺(tái)，固定大鼠頭部及四肢，于頸部正中脫去毛發(fā)，常規(guī)消毒后，用手術(shù)剪剪開(kāi)頸部皮膚，手術(shù)刀頸正中切口，分離頸部?jī)蓚?cè)肌肉，暴露出氣管，用1 mL注射器刺入大鼠氣管軟骨環(huán)間隙，迅速注入博來(lái)霉素溶液（5 mg∕kg）。正常對(duì)照組大鼠相同條件下注入等體積0.9%氯化鈉溶液。藥物注入后立即將大鼠直立，有頻率地輕揉大鼠胸部，使藥液充分?jǐn)U散，縫合、消毒，將大鼠以仰臥位放置于籠中，保持呼吸順暢，清醒后于清潔級(jí)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)〔10〕。

2.3取材及肺指數(shù)計(jì)算連續(xù)給藥第30、45、60、75天時(shí)各處死10只大鼠，取肺用0.9%氯化鈉溶液洗凈，吸水紙吸干并稱重。按下式計(jì)算肺指數(shù)，取左肺固定于10%中性甲醛溶液中，精密稱取右肺0.4 g，制成10%肺組織勻漿液，離心取上清，-80℃保存?zhèn)溆?。ELISA法檢測(cè)勻漿液中的TNF-α和TGF-β1含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定。

2.4病理標(biāo)本制備將左肺組織從10%中性甲醛溶液中取出，取相同部位用石蠟包埋，制作厚度5 m切片，免疫組化染色觀察肺組織中α-SMA與ColⅠ的表達(dá)。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以（）表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ML-HB對(duì)肺指數(shù)的影響給藥4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺指數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組相比，模型組肺指數(shù)均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，ML-HB組肺指數(shù)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 ML-HB對(duì)大鼠肺指數(shù)的影響（，n=10）

表1 ML-HB對(duì)大鼠肺指數(shù)的影響（，n=10）

注：與正常對(duì)照組相比**P＜0.01；與模型組相比△P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型組ML-HB組第30天0.582 6±0.035 9 1.018 5±0.128 0**0.871 3±0.254 2△第45天0.529 9±0.048 6 1.159 6±0.150 4**0.986 9±0.158 8△第60天0.653 0±0.102 2 1.123 1±0.355 8**0.831 3±0.105 6△第75天0.517 6±0.074 7 0.956 6±0.143 4**0.791 6±0.128 4△

3.2 ML-HB對(duì)TNF-α的影響給藥4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與正常對(duì)照組相比，模型組肺組織中TNF-α含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，給藥第30、45天時(shí)，ML-HB組肺組織中TNF-α含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），第60、75天時(shí)，ML-HB組肺組織中TNF-α含量亦降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3.3 ML-HB對(duì)TGF-β1的影響給藥4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組較正常對(duì)照組大鼠肺組織中TGF-β1含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ML-HB組TGF-β1含量顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表2 ML-HB對(duì)大鼠肺組織中TNF-α的影響（，n=10，ng∕mL）

表2 ML-HB對(duì)大鼠肺組織中TNF-α的影響（，n=10，ng∕mL）

注：與正常對(duì)照組相比**P＜0.01；與模型組相比△P＜0.05，△△P＜0.01。

第75天0.283 2±0.047 8 0.451 5±0.165 4**0.305 4±0.062 1△組別正常對(duì)照組模型組ML-HB組第30天0.352 8±0.094 1 0.659 8±0.101 5**0.456 2±0.098 5△△第45天0.389 2±0.073 5 0.714 5±0.097 0**0.435 4±0.067 6△△第60天0.297 7±0.059 4 0.531 0±0.098 3**0.394 2±0.081 9△

表3 ML-HB對(duì)大鼠肺組織中TGF-β1的影響（，n=10，ng∕mL）

表3 ML-HB對(duì)大鼠肺組織中TGF-β1的影響（，n=10，ng∕mL）

注：與正常對(duì)照組相比**P＜0.01；與模型組相比△△P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組ML-HB組第30天2.061 8±0.778 4 4.888 3±1.830 7**2.825 6±1.352 4△△第45天1.974 3±0.541 5 4.554 9±0.728 9**2.806 2±1.115 3△△第60天2.301 2±1.367 1 4.631 8±1.036 8**2.843 9±1.271 2△△第75天2.188 3±0.353 9 4.690 3±1.346 6**2.836 1±0.948 3△△

3.4免疫組化染色法觀察ML-HB對(duì)大鼠肺組織α-SMA和ColⅠ的影響

3.4.1 ML-HB對(duì)α-SMA的影響 給藥4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)正常，隨時(shí)間的延長(zhǎng)有少量α-SMA表達(dá)。模型組第30、45天時(shí)支氣管周?chē)⒀苤車(chē)胺闻蓍g隔有大量的呈棕黃色強(qiáng)陽(yáng)表達(dá)，表明有大量的肌成纖維化細(xì)胞存在，肺纖維化嚴(yán)重，第60天時(shí)有大量肺間質(zhì)細(xì)胞增生遷移，形成的纖維細(xì)胞灶引起肺纖維化，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）大量沉積，造成α-SMA呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，第75天時(shí)α-SMA聚集成團(tuán)，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，肺纖維化更加嚴(yán)重。ML-HB組第30天時(shí)棕黃色顏色較少較淺，未見(jiàn)細(xì)胞間隙液有明顯的α-SMA陽(yáng)性表達(dá)，第45天時(shí)細(xì)胞間隙液有較弱的α-SMA陽(yáng)性表達(dá)，第60、75天時(shí)α-SMA的表達(dá)部位主要集中在氣管或支氣管周?chē)?，未?jiàn)ECM有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與模型組相比，ML-HB組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)肺組織中的陽(yáng)性表達(dá)明顯較低。見(jiàn)圖1。

3.4.2 ML-HB對(duì)ColⅠ的影響 正常對(duì)照組在用藥期內(nèi)肺泡結(jié)構(gòu)正常，只有少量的ColⅠ表達(dá)。模型組第30、45天時(shí)肺間質(zhì)及ECM中可見(jiàn)呈藍(lán)色ColⅠ的陽(yáng)性表達(dá)，第60天時(shí)幾乎沒(méi)有正常的肺泡組織，肺實(shí)變嚴(yán)重，有大量纖維細(xì)胞灶，ColⅠ呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，第75天時(shí)有聚集成團(tuán)的纖維性細(xì)胞，肺實(shí)變嚴(yán)重，ColⅠ也呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。與模型組相比，第30天時(shí)在ML-HB組肺組織的ECM未見(jiàn)ColⅠ大量沉積，藍(lán)色染色較淺較少，第45、60、75天時(shí)ColⅠ在ML-HB組肺組織中的表達(dá)明顯低于模型組。見(jiàn)圖2。

4 討論

肺纖維化的形成是機(jī)體過(guò)度修復(fù)的結(jié)果，當(dāng)致病因素作用于機(jī)體導(dǎo)致肺組織受損傷時(shí)，肺組織內(nèi)的成纖維細(xì)胞在炎癥細(xì)胞和炎癥因子的作用下會(huì)出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞可通過(guò)分泌膠原、纖維連接蛋白等物質(zhì)，使病灶局部形成疤痕，從而維持肺泡結(jié)構(gòu)和功能的完整〔11〕。當(dāng)致病因子持續(xù)作用于機(jī)體引起肺泡上皮細(xì)胞持續(xù)損傷，分泌TNF-α、TGF-β1等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，形成成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致膠原纖維大量沉積〔12〕。

由表1可知，在用藥期間模型組大鼠肺指數(shù)顯著高于正常對(duì)照組，表明肺水腫較嚴(yán)重，經(jīng)ML-HB治療后肺指數(shù)降低。由表2可知，各時(shí)間點(diǎn)ML-HB組中TNF-α的含量低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明ML-HB對(duì)肺組織中TNF-α的表達(dá)有較強(qiáng)的干預(yù)作用。TNF-α是一種前炎癥細(xì)胞因子，能刺激中性粒細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物，釋放溶酶體酶，對(duì)于周?chē)?xì)胞產(chǎn)生毒性作用〔13〕，同時(shí)介導(dǎo)其他細(xì)胞因子和炎癥因子的表達(dá)，增強(qiáng)損傷肺炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，介導(dǎo)肺泡炎癥反應(yīng)，并刺激成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠原合成〔14〕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ML-HB具有抑制TNF-α表達(dá)，從而抑制炎癥進(jìn)一步發(fā)展的作用。

大量研究證實(shí)TGF-β1可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖、并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，刺激成纖維細(xì)胞合成大量I、III型膠原，同時(shí)可抑制膠原酶和纖溶酶的合成，導(dǎo)致膠原降解減少，ECM在肺間質(zhì)中大量形成，導(dǎo)致纖維化〔15-16〕。由表3可知，ML-HB具有抑制肺纖維化模型大鼠肺組織中TGF-β1的表達(dá)，從而起到延緩肺纖維化進(jìn)一步發(fā)展的作用。

α-SMA是肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，肌成纖維細(xì)胞可持續(xù)分泌纖連蛋白、蛋白多糖、層黏連蛋白和膠原等ECM〔17〕，分泌各種生長(zhǎng)因子、炎癥介質(zhì)、趨化因子〔18〕，還能通過(guò)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制因子調(diào)控膠原的合成和代謝〔19〕，因此肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化是導(dǎo)致肺纖維化最為重要和關(guān)鍵的步驟。在正常的肺組織中，ECM的合成與分解代謝處于動(dòng)態(tài)平衡，有助于維持肺組織的正常結(jié)構(gòu)與呼吸功能。α-SMA和ColⅠ是ECM的主要成分，是由肺成纖維細(xì)胞和轉(zhuǎn)型后的肌纖維母細(xì)胞合成和分泌，其過(guò)度蓄積是PF的特征性病理改變〔20〕。本實(shí)驗(yàn)用免疫組化法檢測(cè)α-SMA、ColⅠ在大鼠肺組織中的表達(dá)，直觀地觀察ML-HB對(duì)纖維化大鼠肺組織中肌成纖維細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，α-SMA、ColⅠ在模型組肺組織中的表達(dá)逐漸增多，肺纖維化初期就呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。與模型組相比，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，ML-HB組α-SMA、ColⅠ的表達(dá)明顯降低，表明ML-HB可能通過(guò)調(diào)控α-SMA、ColⅠ在肺組織中的表達(dá)，抑制肌成纖維細(xì)胞的活化增殖、ECM沉積，從而達(dá)到干擾肺纖維化的作用。

研究結(jié)果表明，ML-HB能抑制TNF-α、TGF-β1、α-SMA、ColⅠ的表達(dá)，其作用機(jī)制可能是抑制了炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及巨噬細(xì)胞在肺泡附近的增殖和聚集，降低肌成纖維細(xì)胞的增殖及ECM沉積，從而達(dá)到減緩肺纖維化的作用。肺纖維化的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其對(duì)TNF-α、TGF-β1、α-SMA、ColⅠ等相關(guān)因子的調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究。