張彥如，白 雪，曹 波，林雅雯，張海珠*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137）

云南鼠尾草（Salvia yunnanensisC.H.Wright）是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，又名小丹參、紫丹參、小紅草烏、小紅黨參，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)，其根入藥，有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效〔1〕。云南鼠尾草有著悠久的藥用歷史，明代《滇南本草》曾記載：“一味可抵四物湯補(bǔ)血之功”，民間主要將其用于治療婦科和骨傷疾病等〔2〕。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，云南鼠尾草具有廣泛的生物活性，能抑制和解除血小板聚集，改善微動(dòng)脈、微靜脈痙攣和血液流態(tài)，防止血栓形成，改善微循環(huán)障礙，對(duì)血管重塑具有調(diào)節(jié)作用，增加心肌供氧量的同時(shí)還可以降低需氧量〔3〕；具有抗肝炎、抗病毒和抗腫瘤等活性〔4〕。隨著現(xiàn)代藥理作用的深入研究，云南鼠尾草日益受到重視，市場(chǎng)需求日益增大。

目前鼠尾草屬藥用植物的提取方法主要是以某一有效成分為指標(biāo)，如丹參酮ⅡA、丹酚酸B〔5-7〕，通過多次加熱回流獲得提取物〔8〕。該方法評(píng)價(jià)指標(biāo)單一，僅從化學(xué)角度確定中藥的提取工藝或進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，無法密切關(guān)聯(lián)臨床功效和活性〔9-10〕。有研究表明云南鼠尾草活血功效優(yōu)于丹參，體內(nèi)、體外均能顯著抑制血小板聚集〔2〕，因此本研究針對(duì)其活血的功效指標(biāo)來評(píng)價(jià)云南鼠尾草的最佳提取工藝，彌補(bǔ)了僅僅采用化學(xué)成分檢測(cè)的不足，以期為鼠尾草屬藥用植物的深度開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1藥材與試劑云南鼠尾草經(jīng)大理大學(xué)段寶忠教授鑒定為唇形科植物云南鼠尾草（Salvia yunnanensisC.H.Wright）（產(chǎn)自云南大理，粉粹過20目篩）；甲醇（分析純，四川西隴科學(xué)有限公司）；水合氯醛（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180305）；二磷酸腺苷（ADP，分析純，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：716E021）；二甲基亞砜（DMSO，分析純，富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：821D0311）；0.9%氯化鈉溶液（石家莊四藥有限公司，批號(hào)：2001173203）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)買自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。正式實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境為常規(guī)日夜周期，溫度（21±2）℃，濕度40%～45%，自由進(jìn)食飲水。

1.3儀器AggRAM血小板凝集儀（美國(guó)海倫娜公司）；SK5210HP型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；TGL-18C飛鴿臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭飛鴿儀器有限公司）；RQ∕ZC真空采血管（成都瑞琦科技實(shí)業(yè)股份有限公司）；LGJ-50F冷凍干燥機(jī)（廣州市星爍儀器有限公司）。

2 方法

2.1樣品制備云南鼠尾草藥材在60℃烘箱中干燥6 h至恒重，粉粹后過20目篩。準(zhǔn)確稱量3.000 g藥材細(xì)粉按L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行超聲提取，提取液經(jīng)真空冷凍干燥為粉末，依次命名為E1～E9。準(zhǔn)確稱量不同凍干粉0.100 g，用含5%DMSO的0.9%氯化鈉溶液500 μL超聲溶解，配制成濃度為200 mg∕mL的生藥原液。每種生藥原液按照1：0.7劑距稀釋分別得6個(gè)梯度濃度用于后續(xù)檢測(cè)體外抗血小板聚集能力。測(cè)定前用0.45 μm濾膜過濾，續(xù)濾液即為待測(cè)樣品溶液。正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.2富血小板血漿（PRP）和貧血小板血漿（PPP）的制備健康雄性SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL∕100 g）進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血，以0.13 mol∕L枸櫞酸鈉1：9抗凝。800 r∕min離心10 min，取上清液后，沉淀部分以相同條件再次離心，合并2次上清液得到 PRP；剩余部分以 3 500 r∕min 離心 15 min，吸取上清液即為PPP。PRP和PPP需要保持在18～25℃條件下，以PPP調(diào)節(jié)PRP的血小板濃度至4×108個(gè)∕mL〔11-13〕。

2.3體外抗血小板聚集試驗(yàn)取用PPP 300 μL進(jìn)行透光度調(diào)零，精密量取PRP 250 μL于測(cè)試杯中，然后分別精密加入25 μL待測(cè)樣品溶液，放入磁珠攪拌均勻，預(yù)熱通道內(nèi)37℃溫育3 min，之后再將測(cè)

試杯放入調(diào)零后的檢測(cè)通道，準(zhǔn)確加入25 μL ADP（0.256 mg∕mL），記錄最大血小板聚集率和血小板聚集曲線，每組平行測(cè)定2次，應(yīng)在血液采集后2 h內(nèi)完成檢測(cè)，以含5%DMSO的0.9%氯化鈉溶液作為對(duì)照溶液測(cè)定空白血漿的最大聚集率。

2.4數(shù)據(jù)處理血小板聚集抑制率計(jì)算公式〔14〕如下：

正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值。使用GraphPad Prism 6.01軟件處理抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并繪制濃度-抑制率曲線。

3 結(jié)果

3.1方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 穩(wěn)定性考察 取同一待測(cè)樣品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h按“2.3”項(xiàng)測(cè)定其最大血小板聚集率，計(jì)算RSD。最大血小板聚集率RSD為2.50%，表明待測(cè)樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.2 重復(fù)性考察 取同一待測(cè)樣品溶液6份，在“2.3”項(xiàng)條件下分別測(cè)定，平行測(cè)定2次，記錄樣品溶液的最大血小板聚集率，計(jì)算得RSD為2.36%，說明該試驗(yàn)方法具有良好的重復(fù)性。

3.1.3 精密度考察 取同一待測(cè)樣品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下連續(xù)測(cè)定6次，記錄最大血小板聚集率，計(jì)算RSD，RSD值為1.64%，表明儀器的精密度良好。

3.2云南鼠尾草體外抗血小板聚集作用由圖1可明顯看出，9種不同提取工藝所得云南鼠尾草提取物對(duì)體外ADP誘導(dǎo)的血小板聚集均有抑制作用，且抑制率與提取物濃度呈正相關(guān)；E4對(duì)血小板聚集作用的抑制率最高，其余依次為E3、E8、E7、E6、E2、E9、E5，抑制血小板聚集作用最弱的是E1。不同工藝提取物濃度與抑制率的二次曲線回歸方程見表2。最佳半數(shù)有效濃度（EC50）值越小，提取物抗血小板聚集作用對(duì)應(yīng)的藥液濃度越低，抗血小板聚集效率越高。因此，可以根據(jù)抑制曲線的線性關(guān)系和EC50值來評(píng)價(jià)不同提取物抗血小板聚集作用的效果。

表2 血小板抑制率曲線二次回歸擬合

3.3正交試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)前期試驗(yàn)資料，選取料液比、甲醇濃度、提取時(shí)間及提取次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定從云南鼠尾草中提取發(fā)揮活血功效化學(xué)成分的最佳超聲提取條件，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

由表3分析可知，甲醇濃度的極差最大（19.006），說明甲醇濃度對(duì)云南鼠尾草中發(fā)揮活血功效化學(xué)成分的提取影響最大，其次是提取次數(shù)、料液比，最后是提取時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素影響程度大小為甲醇濃度（D）＞提取次數(shù)（A）＞料液比（C）＞提取時(shí)間（B）。由表4中P值可知，因素D對(duì)提取效果具有顯著影響（P＜0.05），而因素A、B、C無顯著影響（P＞0.05）。結(jié)合云南鼠尾草體外抗血小板聚集作用結(jié)果，E4的血小板聚集作用抑制率最高，故云南鼠尾草中活血功效化學(xué)成分的最佳提取條件是A2B1C2D3，即料液比1：15、甲醇濃度100%、提取時(shí)間30 min、提取次數(shù)2次。在此條件下，測(cè)得體外ADP誘導(dǎo)抗血小板聚集的EC50為4.141 mg∕mL。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析

4 討論

云南鼠尾草主要分布于云南、貴州、四川等地，在西南地區(qū)有近600年的藥用歷史，其味苦、微寒，《紅河中草藥》中記載：“活血行瘀，調(diào)經(jīng)止痛”，是彝族、苗族、白族等少數(shù)民族常用藥材〔15〕。雖然云南鼠尾草未被《中國(guó)藥典》收載，但已被云南、貴州等省中藥材部頒標(biāo)準(zhǔn)所收載，目前市場(chǎng)上以云南鼠尾草為原料的藥品主要有丹莪婦康煎膏、紫燈膠囊、紫丹活血片、銀丹心泰滴丸、龍金通淋膠囊等。其相關(guān)的單方和成方制劑在婦科、心系、骨傷和血瘀腫痛等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用〔2〕，具有良好的民間臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)和基礎(chǔ)，鑒于此應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)其物質(zhì)基礎(chǔ)與藥效間的相關(guān)研究，促進(jìn)云南鼠尾草的資源利用和產(chǎn)品開發(fā)，使其更好地服務(wù)于人類。

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明確，具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。現(xiàn)有的提取工藝方法多數(shù)以指標(biāo)性成分的含量測(cè)定為主，根據(jù)某一個(gè)或幾個(gè)化學(xué)成分含量的多少來評(píng)判提取方法的優(yōu)劣。例如，大黃藥材的提取工藝研究中以總游離蒽醌〔16〕、大黃酸〔17〕、番瀉苷 A〔18〕等含量來確定最佳提取工藝，其中總游離蒽醌與大黃瀉下通便的功效幾無關(guān)聯(lián)，且與大黃利濕退黃、清熱瀉火的功效關(guān)系也不明確，因此單一指標(biāo)性成分的定量分析難以實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材提取工藝全面客觀的評(píng)價(jià)。

目前從云南鼠尾草中共分離鑒定了85種化合物，主要化學(xué)成分為脂溶性菲醌化合物和水溶性酚酸類化合物〔19〕。云南鼠尾草中發(fā)揮活血功效的成分有丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹參素、迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、異阿魏酸等〔20〕，顯然僅以單一成分為指標(biāo)研究云南鼠尾草的提取工藝存在明顯不足。因此本研究以活血功效為指征，緊密結(jié)合臨床療效，從整體活血成分群考察云南鼠尾草的最佳提取工藝。

由于實(shí)驗(yàn)條件有限，未開展云南鼠尾草中發(fā)揮活血功效的活性成分及其抗血小板聚集作用強(qiáng)弱研究。因此，課題延續(xù)工作將圍繞建立系統(tǒng)方法考察云南鼠尾草中活性成分的抗血小板作用機(jī)制，為進(jìn)一步篩選出高療效、低副作用、高生物利用度的活血化瘀藥物奠定基礎(chǔ)。