張小利，路發(fā)凱，馬夢杰

（上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海201401）

0 引言

花丹安神合劑是以落花生枝葉為君藥、丹參為臣藥的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，具有良好的鎮(zhèn)靜、催眠作用，與傳統(tǒng)苯二氮?類及其他催眠藥相比，呈現(xiàn)出安全、副作用小的特點。物質(zhì)基礎(chǔ)研究表明，N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸和丹參素是其有效成分［1-3］，因此在新藥研發(fā)過程中，建立以N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸和丹參素（丹參的指標性成分）為花丹安神合劑質(zhì)量標準中的含量控制治療具有重要意義［4］。本研究采用HPLC-ELSD 法測定了該制劑中N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量，方法簡單，專屬性強，以用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀，Empower 2 色譜工作站（美國安捷倫公司）；JY20002 檢測器：Alltech?3300 ELSD 檢測器；十萬分之一電子天平（上海精密儀器有限公司）；SG5200HE 超聲清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；H1650 臺式高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。

1.1 試劑

乙腈為色譜純，水為Millipore 制備的超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 試藥

N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸（上海醫(yī)藥工業(yè)研究院中藥室制備，純度98.90%）；落花生枝葉（批號：20140618）、花丹安神合劑（批號：1408001）均由上海凱寶藥業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC-Pack Polyamine Ⅱ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：75%乙腈；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測器：Alltech?3300 ELSD 檢測器；ELSD參數(shù)：漂移管溫度48 ℃，氣體流量1.8 L/min，增益1。理論塔板數(shù)按N-甲基-反式4-羥基-L-脯氨酸計算應(yīng)不低于4 000。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸標準品25.0 mg，置于25 mL量瓶中，于25 ℃環(huán)境溫度下，加水溶解，搖勻，并稀釋至刻度，過0.22 μm 濾膜過濾即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品5支，混勻，精密吸取花丹安神合劑2 mL，置于10 mL量瓶中，于25 ℃環(huán)境溫度下，加水溶解，搖勻，并稀釋至刻度，超聲30 min，過0.22 μm 濾膜過濾即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液5，8，10，15，20 μL 進樣，按上述色譜條件測定。以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸標準品的回歸方程為Y=836.32X-1 069.2（r=0.999 8）。結(jié)果表明，標準品的進樣量在5.00～20.00 μg 范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。對照品色譜如圖1所示。

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸溶液10 μL 進樣，重復(fù)6 次，測得峰面積RSD 為0.74%（n=6），表明該實驗所用儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液10 μL 進樣分析，然后分別于0，1，2，4，8，24，48 h 時重復(fù)進樣一次。測得峰面積的RSD 為1.73%，表明樣品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品6 份，按外標法計算含量，分別為99.56%，99.50%，99.60%, 99.59%，98.66%和99.22%，平均含量為99.22%，RSD 為0.46%。結(jié)果表明，本法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗

精密量取已知N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸含量的花丹安神合劑（批號：1408001）2 mL，共6 份，分別至10 mL 量瓶中，精密加入“2.2”項下N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸對照品溶液1.0 mL，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算回收率。結(jié)果表明：6 份供試品的平均加樣回收率為96.76%，RSD 為1.53%。

2.9 樣品含量測定

取3批花丹安神合劑樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，以外標法計算N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量，結(jié)果如表1所示。供試品溶液色譜，如圖2所示。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸的極性非常大，在C18 反相柱中無保留，因此選擇正相行為的氨基柱進行分析。通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸在YMC-Pack Polyamine Ⅱ色譜柱上有較好的保留，且分離度良好，因此我們選擇YMCPack Polyamine Ⅱ色譜柱進行分析檢測。

3.2 流動相的選擇

在對流動相考察時，主要選擇了甲醇水系統(tǒng)與乙腈水系統(tǒng)進行分析測試。首先，乙腈水系統(tǒng)作為流動相時，最初嘗試了70%乙腈水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)以蒸發(fā)光檢測器為檢測器的情況下，其基線漂移較大，且保留時間較短；之后嘗試了85%乙腈為流動相，基線平穩(wěn)，但是出峰時間較晚，經(jīng)過比較，最終選擇75%乙腈為流動相，N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸的保留時間為9.2 min 左右。

圖1 N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸對照品HPLC-ELSD 色譜

表1 含量測定結(jié)果（n=3）

圖2 供試品溶液中N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸HPLC-ELSD 色譜

3.3 檢測器的選擇

N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸紫外吸收非常弱，即使用末端吸收195 nm 作為檢測波長，其色譜信號也比較微弱，檢測信號不夠靈敏，最終造成檢測結(jié)果誤差較大。此外，示差檢測器是一種通用型檢測器，但是由于其靈敏度低，對環(huán)境溫度和流動相的波動影響較大，且基線不穩(wěn)，與梯度洗脫不相容等缺點導(dǎo)致其不能應(yīng)用于N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸的檢測。

值得注意的是，蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）也是一種通用型檢測器，其響應(yīng)值不依賴于樣品的光學(xué)特性，檢測靈敏度高于示差檢測器，任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測到。另外，在急變梯度時，低波長紫外檢測器也受基線漂移的困擾，而ELSD 則不受這些限制，使得其分辨率更好、分離速度更快。鑒于ELSD的上述優(yōu)點，采用該檢測器對N-甲基-反式-4-羥基-L-脯氨酸樣品進行純度檢測［5-9］。

4 結(jié)語

方法學(xué)研究結(jié)果表明：各項指標均符合HPLCELSD 分析的要求，具有簡單快速的特點，可用于該制劑的質(zhì)量控制。