劉敏軒，趙興然，于璐，鹿浩志，王向紅

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

頭孢菌素類抗生素是7-氨基頭孢烷酸（7-aminocephalosporanic acid，7-ACA）的衍生物[1-2]，多為有機(jī)酸性物質(zhì)，頭孢菌素類抗生素的殺菌作用較強(qiáng)，常被用來預(yù)防和治療動(dòng)物性疾病，并存在多種抗生素聯(lián)用的現(xiàn)象，因而在動(dòng)物源性食品中可能存在抗生素殘留問題[3]。由于動(dòng)物源性食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，動(dòng)物產(chǎn)品消費(fèi)量巨大，動(dòng)物源性食品中抗生素殘留問題也日益受到人們的廣泛關(guān)注[4-5]。頭孢菌素類抗生素的濫用會(huì)造成其在畜產(chǎn)品中的殘留，人類食用后會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)、胃腸道菌群失衡和細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)等不良影響[6-7]。因此，建立一種高效、便捷、快速的頭孢菌素類抗生素多殘留測(cè)定方法極為迫切。

目前，頭孢菌素類抗生素殘留的檢測(cè)方法主要有微生物分析法、免疫分析法（immunoassay，IAS）、液相色譜法（liquid chromatography，LC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）和電化學(xué)分析法等。微生物法[8]檢測(cè)的時(shí)間較長(zhǎng)、靈敏度低、操作人員要求高；高效液相色譜法（high perfor mance liquid chromatography，HPLC）[9-13]等儀器檢測(cè)法程序復(fù)雜、成本較高，不利于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的測(cè)定；電化學(xué)分析法由于其穩(wěn)定性欠佳，還沒有普遍推廣使用[14]。眾多檢測(cè)方法中，膠體金免疫層析技術(shù)[15-16]憑借其操作簡(jiǎn)單易行、分析時(shí)間短、檢測(cè)效率高、結(jié)果可靠準(zhǔn)確、適合樣品大批量現(xiàn)場(chǎng)快速篩檢等優(yōu)勢(shì)被廣泛用于食品安全檢測(cè)，應(yīng)用前景廣闊。

為了建立一種用于頭孢菌素類抗生素殘留測(cè)定的快速檢測(cè)方法，本研究采用膠體金作為信號(hào)探針，基于免疫競(jìng)爭(zhēng)原理，以硝酸纖維素膜（NC膜）為反應(yīng)載體，以頭孢氨芐（cefalexin，CEX）包被原（CEX-OVA）為檢測(cè)線（T線），羊抗兔二抗為質(zhì)控線（C線）開發(fā)了檢測(cè)頭孢菌素類抗生素的膠體金免疫層析試紙條，并成功通過樣品的添加回收試驗(yàn)，驗(yàn)證了其實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

頭孢氨芐抗血清：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院食品分析與營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，采用謝會(huì)玲等[17]的方法制得；頭孢氨芐（cefalexin，CEX）、頭孢拉定（cefradine，RAD）、頭孢羥氨芐（cefadroxil，CFR）、頭孢哌酮（cefoperazone，CFP）、頭孢唑啉鈉（cefamezin，CZN）、頭孢唑啉（cefazolin，CFZ）、頭孢噻肟（cefotaxime sodium，CTX）、頭孢呋辛（cefuroxim，CXM）：上海源葉科技有限公司（上海）；氯金酸、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）：Sigma公司（美國(guó)）；N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）：阿拉丁化學(xué)有限公司（上海）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffered saline with Tween 20，PBST）、硼酸緩沖液、羊抗兔IgG：北京索萊寶有限公司（北京）；NC膜：Millipore公司（美國(guó)）；樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙以及PVC底板：上海金標(biāo)科技有限公司（上海）；待測(cè)樣品：保定人人超市（保定）；其他化學(xué)試劑均為分析純。

恒溫磁力攪拌器（JB-2型）：上海一恒電子科技有限公司（上海）；恒溫培養(yǎng)箱（DH5000Ⅱ）：上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司（上海）；冷凍離心機(jī)（TDL-5）：上海Anke（上海）；半自動(dòng)劃膜儀XYZ3010：上海捷寧生物（上海）。

1.2 方法

1.2.1 CEX包被原的制備

合成步驟采用Matsuura等[18]的方法。稱取20.00 mg CEX、13.25 mg NHS、26.11 mg DCC 溶于 1.40 mL DMF中，經(jīng)渦旋混勻，于室溫25℃孵育3h。取900μL反應(yīng)液慢慢滴加到3 mL NaHCO3溶液中（濃度為0.10 mol/L，含有20.20 mg OVA），低溫振蕩反應(yīng)2 h以上，置于4℃冰箱中反應(yīng)過夜，得到包被原CEX-OVA。用紫外分光光度計(jì)法對(duì)偶聯(lián)物CEX-OVA進(jìn)行表征，在200 nm～500 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行掃描，通過組分特征峰推斷偶聯(lián)物是否制備成功。

1.2.2 膠體金的制備與表征

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[19]。將1gHAuCl4配成1%的水溶液，于4℃避光存放，使用時(shí)再配制成0.01%的溶液。在磁力攪拌下，將0.01%HAuCl4水溶液加熱至沸騰并保持3 min，迅速加入檸檬酸三鈉溶液，待其變?yōu)橥该鞯募t色且保持不變時(shí)，煮沸5 min，撤去熱源，攪拌15 min。自然冷卻至室溫25℃，加雙蒸水至原體積，通過紫外掃描和透射電鏡法對(duì)制備的膠體金進(jìn)行表征。

1.2.3 金標(biāo)抗體的制備

將純化后的抗體蛋白用硼酸緩沖液進(jìn)行稀釋，磁力攪拌下，逐滴加入到10 mL膠體金溶液（pH=9.0）中，繼續(xù)攪拌10 min，加入10%BSA至其終濃度為1%，繼續(xù)攪拌30 min后4℃靜置過夜。取出溶液于4℃低速離心除去沉淀，上清液于10 000 r/min低溫離心30 min。去上清，用儲(chǔ)存液將暗紅色沉淀重懸，重復(fù)離心1次，重懸至1 mL，4℃放置。

1.2.4 標(biāo)記CEX抗體蛋白條件的優(yōu)化

將 100 μL 不同 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0）的膠體金溶液置于酶標(biāo)板中，每孔加入3 μg CEX抗體，混勻后于室溫25℃放置15 min，每孔添加20 μL 10%NaCl溶液，混勻后于525 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。

分別向1 mL的膠體金溶液中加入不同濃度的抗體（0.0、1.5、3.0、4.5、6.0、9.0、12.0、24.0、48.0 μg/mL），混勻后加入100 μL 10%NaCl溶液，反應(yīng)1 h后于525 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。

1.2.5 試紙條檢測(cè)條件的優(yōu)化

將二抗點(diǎn)樣于NC膜上，分別用不同的封閉液（1%BSA、1%明膠、1%酪蛋白、5%脫脂乳和5%甘氨酸）在37℃條件下封閉30 min，取出后用PBST沖洗3次，干燥，滴加金標(biāo)抗體進(jìn)行顯色，選擇顯色條帶清晰且無背景色的封閉液。分別采用0.5、1.0、1.5 μg的CEXOVA為包被區(qū)，將金標(biāo)抗體分別按1∶1、1∶5和1∶10體積比稀釋后，取100 μL滴加到包被區(qū)，選擇顯色效果較好的濃度和稀釋比例應(yīng)用于試驗(yàn)。

1.2.6 樣品前處理及添加回收驗(yàn)證

牛奶樣品取全奶6 mL于離心管，4℃，9 000 r/min離心15 min，棄掉上層脂肪，取下層；牛肉、豬肉、蝦肉樣品，稱取均質(zhì)試樣（1.0±0.001）g，按 1 ∶1（質(zhì)量體積比）加入乙腈水溶液（8∶2，體積比），漩渦振蕩，超聲提取15 min，于室溫（20℃～25℃）、3 500 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm有機(jī)濾膜備用。生豬肝、熟豬肝樣品使用1∶3（質(zhì)量體積比）乙腈水溶液（8∶2，體積比），4 000 r/min離心，取上清液過0.45 μm有機(jī)濾膜備用。向樣品中添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。本試驗(yàn)通過HPLC方法對(duì)試紙條的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外分光光度計(jì)法鑒定CEX-OVA的合成

抗原和膠體金的表征見圖1。

圖1 抗原和膠體金的表征Fig.1 Characterization of antigen and colloidal gold

圖1a為CEX、OVA和CEX-OVA的紫外掃描圖，可知CEX與載體OVA偶聯(lián)后，其偶聯(lián)產(chǎn)物CEX-OVA的吸收?qǐng)D譜分別具有CEX與OVA的特征吸收峰，O VA偶聯(lián)CEX后蛋白質(zhì)的特征峰形狀和位置發(fā)生了變化，表現(xiàn)為各自迭加的性質(zhì)，初步說明OVA分子上已經(jīng)成功偶聯(lián)CEX。

2.2 膠體金紫外掃描法和透射電鏡法的鑒定結(jié)果

從光譜圖1b可知，制得的膠體金溶液在525 nm處有最大吸收峰，由最大吸收波長(zhǎng)λmax與膠體金顆粒的線性回歸方程 Y（λmax）=0.427 1X（顆粒直徑）+514.56[20]，可初步估算出金顆粒的直徑約為24.4 nm，吸收峰峰寬為 149 nm。由式 Y（CV）=0.360 5X（峰寬）-53.549可得，直徑變異系數(shù)CV為16.6%，表明溶液中金顆粒的粒徑分布較均勻。

膠體金的透射電鏡圖1c、圖1d所示，膠體金顆粒的大小基本一致，分散較均勻，沒有多角形的顆粒存在，直徑約為24 nm，與紫外掃描結(jié)果基本一致。

2.3 膠體金標(biāo)記CEX抗體條件的確定

膠體金標(biāo)記CEX抗體條件的確定試驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見圖2。

圖2 試驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization of the experimental parameters

圖2a為不同pH值條件下金標(biāo)抗體OD值的變化，隨著體系pH值的升高，金標(biāo)抗體的OD值不斷升高，當(dāng)pH值達(dá)到9.0時(shí)，金標(biāo)抗體的OD值達(dá)到最高，然后趨于穩(wěn)定并逐漸減小，說明當(dāng)體系pH值達(dá)到9.0時(shí)，金納米顆粒與抗體二者結(jié)合最為穩(wěn)定。故標(biāo)記抗體蛋白的溶液pH值選9.0。由圖2b可知，當(dāng)抗體蛋白用量小于9 μg時(shí)，吸光值隨著抗體蛋白用量的增加而增大，當(dāng)抗體蛋白用量大于9 μg時(shí)，吸光度值趨于平衡。表明抗體蛋白用量為9 μg時(shí)與膠體金結(jié)合最佳。

2.4 封閉液的優(yōu)化

為了降低NC膜的非特異性吸附，需要用封閉液對(duì)膜上未結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行封閉，結(jié)果如表1。

表1 試紙條的封閉結(jié)果Table 1 The blocking results of the strips

未進(jìn)行封閉處理、經(jīng)5%甘氨酸、經(jīng)1%BSA封閉處理的NC膜背景色較深，降低了檢測(cè)線與背景的反差，影響結(jié)果的判斷；經(jīng)1%酪蛋白封閉處理的NC膜背景色較淺，條帶顯色較清晰；而經(jīng)1%明膠和5%脫脂乳封閉處理的NC膜背景色較淺，條帶顏色鮮明，容易判斷結(jié)果。經(jīng)5%脫脂乳封閉的NC膜條帶顯色最鮮明，封閉效果最為理想，且脫脂乳廉價(jià)易得。因此本試驗(yàn)試紙條封閉液采用5%的脫脂乳。

2.5 CEX-OVA包被量和金標(biāo)抗體稀釋度的確定

CEX-OVA包被量和金標(biāo)抗體稀釋度與試紙條的顯色結(jié)果直接相關(guān)，結(jié)果如表2。

表2 金標(biāo)抗體稀釋度和包被原CEX-OVA包被量的優(yōu)化Table 2 Optimization of the dilution fold of the gold-labeled antibodies and coated antigen CEX-OVA

當(dāng)包被0.5 μg的CEX-OVA時(shí)，T線處結(jié)合的金標(biāo)抗體比較少，顯色較淺；包被量為1.5 μg時(shí)，T線的顯色偏深，1.0 μg與1.5 μg的顯色效果基本相同。當(dāng)金標(biāo)抗體的稀釋度在1∶5時(shí)，3個(gè)包被量的試紙條顯色情況均較好。因此選擇包被1.0 μg的包被原，金標(biāo)抗體的稀釋度為1∶5。

2.6 二抗稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

將二抗進(jìn)行稀釋作為C線，取金標(biāo)抗體稀釋液100 μL滴加到包被區(qū)顯色，優(yōu)化結(jié)果見圖3。

圖3 酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)的優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Result of HRP antibody conjugates for different dilution fold

由圖3可知，隨著二抗稀釋倍數(shù)的加大，C線的顯色越來越淺。當(dāng)稀釋倍數(shù)為20時(shí)，NC膜上C線的顯色較T線深，不利于測(cè)定結(jié)果的判斷；稀釋倍數(shù)為40時(shí)，C線的顯色與T線相當(dāng)，易于進(jìn)行結(jié)果的判斷；當(dāng)稀釋倍數(shù)為80、160、320時(shí)，NC膜上C線的顯色明顯淺于T線，基本不可見，影響試紙條的有效性。所以，二抗的最佳稀釋倍數(shù)為40倍。

2.7 CEX檢出限的確定

將制備的膠體金試紙條對(duì)CEX的檢測(cè)限進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 CEX膠體金試紙條檢出限的確定Fig.4 The detection limit of colloidal gold strips for CEX

隨著CEX濃度的依次增大，T線的顏色越來越淺，當(dāng)CEX的濃度小于20 μg/L時(shí)，T線顏色明顯肉眼可見，與空白溶液不能由目測(cè)法進(jìn)行區(qū)分；當(dāng)其濃度等于或大于20 μg/L，T帶顯色較淺甚至消失，能通過目測(cè)將兩者分開，因此該試紙條對(duì)于CEX的檢出限為20 μg/L。

2.8 膠體金試紙條特異性的檢測(cè)

在最優(yōu)檢測(cè)條件下，所制試紙條對(duì)頭孢菌素類抗生素的檢測(cè)靈敏度差異較大，用同樣的方法檢測(cè)其他7種頭孢類抗生素，結(jié)果如圖5所示。

圖5 其他7種頭孢菌素類抗生素的試紙條檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Test strip test results of 7 other cephalosporin antibiotics

該試紙條對(duì)CFP、CZN、CFZ、CTX和CXM的特異性不明顯，對(duì)這幾種頭孢菌素類抗生素?zé)o交叉反應(yīng)，但對(duì)CEX、RAD、CFR的靈敏度較高，即交叉反應(yīng)率高，可進(jìn)一步研究多殘留檢測(cè)。由顯色結(jié)果可判斷7種抗生素的檢測(cè)限，如表3所示。

表3 CEX和其他7種頭孢菌素類抗生素的檢測(cè)限Table 3 Detection limits for CEX and seven other cephalosporin antibiotics

2.9 待測(cè)物的添加回收試驗(yàn)和HPLC方法驗(yàn)證

蝦肉提取液進(jìn)行20倍稀釋，牛奶、牛肉、豬肉提取液進(jìn)行40倍稀釋，生豬肝、熟豬肝提取液進(jìn)行80倍稀釋后，用試紙條檢測(cè)，條帶顯色清晰且無背景色，顯色效果與對(duì)照接近，即基質(zhì)影響基本消除。6種樣品的加標(biāo)提取液經(jīng)過基質(zhì)消除后，用試紙條測(cè)定，低檢出限為 20 μg/L，結(jié)果如表 4。

表4 6種樣品的CEX添加回收檢測(cè)結(jié)果Table 4 The determination results of CEX in six samples

用HPLC法與試紙條（n=3）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表5所示。

表5 樣品中不同CEX添加水平的HPLC與試紙條測(cè)定結(jié)果比較Table 5 CEX of results obtained by HPLC and strips at three spiked level

續(xù)表5 樣品中不同CEX添加水平的HPLC與試紙條測(cè)定結(jié)果比較Continue table 5 CEX of results obtained by HPLC and strips at three spiked level

所建立試紙條法與HPLC法在檢測(cè)范圍內(nèi)有很好的相關(guān)性，即試紙條法準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

3 討論

本文建立了快速檢測(cè)動(dòng)物源性食品中CEX殘留量的膠體金標(biāo)記免疫分析方法。通過對(duì)試紙條檢測(cè)條件優(yōu)化，對(duì)CEX檢測(cè)限為20 μg/L，經(jīng)過樣品提取液校正后其檢測(cè)限為20 μg/L，整個(gè)檢測(cè)過程僅需10 min，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CEX的快速檢測(cè)。用HPLC法對(duì)試紙條的可靠性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明兩者一致性較好，即試紙條法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。適用于實(shí)際動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類抗生素樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。成功建立可檢測(cè)頭孢類抗生素殘留膠體金免疫層析試紙條。