（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物藥學(xué)院，江蘇泰州225300）

香菇又稱為香菌、花菇、香蕈，是一種藥食同源的中藥材。香菇的有效成分主要包括香菇多糖、香菇嘌呤、微量元素等[1]，其中香菇多糖是香菇的主要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗病毒等作用[2-6]。香菇中多糖與蛋白質(zhì)共存，兩者均是香菇細(xì)胞的重要組分。熱水浸提法等方法在提取出香菇中的水溶性多糖類成分的同時(shí)，部分熱穩(wěn)定性強(qiáng)的蛋白質(zhì)及其它水溶性成分也會(huì)一起轉(zhuǎn)移至提取液中。目前，傳統(tǒng)的Sevag法、離子交換色譜法及酶法等多糖脫蛋白工藝復(fù)雜，效率不高[7-8]。低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）是一種環(huán)境友好型的類離子液體，具有性質(zhì)穩(wěn)定、選擇性強(qiáng)、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，并在天然產(chǎn)物、金屬離子、有機(jī)物等分離領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景[9-11]。本文采用DES與無機(jī)鹽溶液構(gòu)成雙水相體系（aqueous twophase system，ATPS），為香菇多糖脫蛋白質(zhì)提供一種新型有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇：西峽縣雷氏菇品購銷有限公司。將香菇烘干、粉碎，過20目篩，備用。

無水葡萄糖對(duì)照品、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV-1800PC-DS2紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器：國華電器有限公司；XMTD-8222電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海姚氏儀器設(shè)備廠；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵：河南省予華儀器有限公司；HK-02A多功能粉碎機(jī)：上海燁昌食品機(jī)械有限公司；80-2臺(tái)式電動(dòng)離心機(jī)：金壇市杰瑞爾電器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[12]，以無水葡萄糖為對(duì)照品，采用苯酚-硫酸顯色法測(cè)定多糖的濃度，以吸光度（y）對(duì)葡萄糖濃度（x）回歸，得回歸方程為y=0.014 2x-0.006 9（R2=0.996 5），表明在 10.56 μg/mL～52.8 μg/mL 范圍內(nèi)葡萄糖濃度與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[13]，以牛血清白蛋白為對(duì)照品，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。以蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A595）為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=0.003 49x-0.005 53（R2=0.995 6），表明在 43.42 μg/mL～203.02 μg/mL范圍內(nèi)蛋白質(zhì)濃度與其吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.3 香菇多糖水提液的制備

稱取香菇粉35 g，加500 mL蒸餾水，50℃水浴攪拌提取約2 h，抽濾得到香菇多糖水提液，4℃保存。

2.4 香菇多糖水提液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定

精密移取2.00mL香菇多糖水提液，按照2.2進(jìn)行測(cè)算，得出香菇多糖水提液中蛋白質(zhì)濃度為151.44μg/mL。以下試驗(yàn)均采用此濃度的香菇多糖水提液。

2.5 低共熔溶劑DES的合成

參考文獻(xiàn)[14]，分別合成 DES 1[氯化膽堿（0.1 mol，13.962 g）和尿素（0.2 mol，12.012 g）]、DES 2[（氯化膽堿（0.1 mol，13.962 g） 和甲基脲 （0.2 mol，14.816 g）]、DES 3[（氯化膽堿（0.1 mol，13.962 g）和丙三醇（0.2 mol，18.418 g）]、DES 4[（氯化膽堿（0.1 mol，13.962 g）和乙二醇（0.2 mol，12.414 g）]4 種低共熔溶劑。

2.6 K2HPO4溶液的配制及DES-鹽雙水相體系的構(gòu)建

稱取一定量K2HPO4溶于50 mL蒸餾水中，配制成不同濃度的K2HPO4溶液。向試管中加入一定量的DES，再加入適量K2HPO4溶液，充分振蕩、混合后，靜置，觀察是否成為清晰的兩相，研究體系成相規(guī)律。

2.7 蛋白質(zhì)的脫除及含量測(cè)定

向刻度離心管中加入3 mL DES、3 mL K2HPO4溶液及2 mL香菇多糖水提液，2 000 r/min離心萃取30 min。操作結(jié)束后，將離心管取出，待兩相完全分離后，分別讀取上相和下相的體積，并用苯酚-硫酸顯色法和考馬斯亮藍(lán)法分別測(cè)定上、下兩相中多糖和蛋白質(zhì)的濃度。

蛋白質(zhì)的脫除率（E）按式（1）計(jì)算。

式中：ct1和cb1分別為萃取完全后蛋白質(zhì)在上相（DES相）和下相（無機(jī)鹽相）中的濃度，μg/mL；Vt和Vb分別為雙水相上相和下相的體積，mL；R為該雙水相體系上下相體積比。

香菇多糖回收率（Y）按式（3）計(jì)算。

式中：ct2和cb2分別為萃取完全后多糖在上相（DES相）和下相（無機(jī)鹽相）中的濃度，μg/mL；Vt和 Vb分別為雙水相上相和下相的體積，mL。

2.8 香菇多糖抗氧化活性研究

采用DPPH法[15-18]，準(zhǔn)確移取1.00 mL脫蛋白后的香菇多糖溶液，加入預(yù)先配置好的4 mL 0.15 mmol/L的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH自由基）甲醇溶液，搖勻后暗處放置30 min，以樣品溶劑為空白，測(cè)定其在515 nm波長處測(cè)定其吸光度A，同時(shí)測(cè)定樣品溶液在515 nm處的吸光度A0及DPPH甲醇溶液在515 nm處的吸光度A1，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 DES種類的篩選

將氫鍵受體（氯化膽堿）與氫鍵供體（尿素、甲基脲、丙三醇、乙二醇）按照物質(zhì)的量之比1∶2合成4種低共熔溶劑，與0.5 g/mL K2HPO4溶液組成雙水相體系，成相效果如圖1所示。

圖1DES-K2HPO4成相圖Fig.1 Photo of Four DES-K2HPO4aqueous two-phase systems

據(jù)圖1可知，試管1（氯化膽堿/丙三醇DES 1-K2HPO4）和試管 4（氯化膽堿/尿素 DES 4-K2HPO4）成相效果較好。

按2.7方法，比較4種DES構(gòu)建的雙水相對(duì)香菇多糖水提液中蛋白質(zhì)的脫除率，結(jié)果見表1。

表1 DES種類對(duì)蛋白質(zhì)分配系數(shù)和脫除率的影響Table 1 Effect of DES types on protein partition coefficient and removal rate

由表1可知，相同條件下，DES 1（氯化膽堿/丙三醇）雙水相對(duì)香菇多糖蛋白質(zhì)的脫除率最高，最高脫除率可達(dá)85.41%，且DES 1-K2HPO4成相效果較好，由此，在后續(xù)試驗(yàn)中選用DES 1（氯化膽堿/丙三醇）構(gòu)建雙水相。

3.2 雙水相體系成相規(guī)律

3.2.1 K2HPO4濃度對(duì)雙水相體系的影響

向3 mL氯化膽堿/丙三醇（物質(zhì)的量之比1∶2）DES中加入3 mL不同濃度的K2HPO4溶液。當(dāng)K2HPO4濃度由0.3 g/mL增加到0.8 g/mL時(shí)，上相（含DES）體積（Vt）逐漸變少，下相（含K2HPO4）體積（Vb）逐漸增加，上下相體積比R（Vt/Vb）顯著減小。結(jié)果見圖2。

圖2 K2HPO4濃度對(duì)雙水相體系的影響Fig.2 Effect of K2HPO4concentration on aqueous two-phase system

3.2.2 DES加入量對(duì)雙水相體系的影響

向 K2HPO4溶液（0.5 g/mL，3 mL）中加入一定量的氯化膽堿/丙三醇（物質(zhì)的量之比1∶2）DES，當(dāng)DES加入量由1.8 mL增加至3.8 mL時(shí)，富含DES的上相體積（Vt）逐漸增大，富含下相無機(jī)鹽的體積（Vb）逐步減少，上下相體積比R逐漸變大，結(jié)果見圖3。

圖3 DES加入量對(duì)雙水相體系的影響Fig.3 Effect of DES addition on aqueous two-phase system

由圖3可見，K2HPO4的濃度和DES的加入量對(duì)雙水相成相體系有影響，進(jìn)而對(duì)蛋白質(zhì)的脫除率有影響。因此可以通過調(diào)節(jié)K2HPO4的濃度和DES的加入量來獲得滿意的脫除率。

3.3 單因素試驗(yàn)

3.3.1 氯化膽堿/丙三醇物質(zhì)的量比對(duì)蛋白質(zhì)脫除率的影響

以 DES 1（3 mL）與 K2HPO4（0.5 g/mL，3 mL）構(gòu)建雙水相體系，向其中加入香菇多糖水提液2.00 mL，2 000 r/min離心30 min，DES1物質(zhì)的量比對(duì)雙水相體系中香菇多糖蛋白質(zhì)萃取行為的影響如表2所示。

由表2可知，蛋白質(zhì)在雙水相體系分配系數(shù)K1大多超過1，而香菇多糖在雙水相體系分配系數(shù)K2較小，說明蛋白質(zhì)富集在上相，多糖富集在下相。在K2HPO4和香菇多糖水提液的量一定時(shí)，當(dāng)氯化膽堿/丙三醇物質(zhì)的量比為1∶2時(shí)，香菇多糖蛋白質(zhì)擁有最大的脫除率，可達(dá)87.09%。在后續(xù)的單因素試驗(yàn)中，選用氯化膽堿/丙三醇（物質(zhì)的量之比1∶2）制備低共熔溶劑。

表2 DES 1物質(zhì)的量比對(duì)E、Y的影響Table 2 Effect of the ratio of DES 1 substance on E and Y

3.3.2 K2HPO4溶液濃度對(duì)蛋白質(zhì)脫除率的影響

以DES 1（物質(zhì)的量之比1∶2，3 mL）與K2HPO4（3 mL）構(gòu)建雙水相體系，向該體系中加入2mL香菇多糖水提液，離心參數(shù)設(shè)置同3.3.1，K2HPO4溶液的濃度對(duì)該雙水相體系中的香菇多糖蛋白質(zhì)脫除率的影響如表3所示。

表3 K2HPO4溶液濃度對(duì)E、Y的影響Table 3 Effect of K2HPO4solution concentration on E and Y

由表3可知，當(dāng)K2HPO4濃度在0.3 g/mL～0.6 g/mL范圍內(nèi)，隨著其濃度的增加，蛋白質(zhì)的脫除率隨之增高，這是因?yàn)橄孪嗫臻g的緊密度會(huì)影響蛋白質(zhì)的脫除率，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)進(jìn)入到上相DES相中[14]。當(dāng)K2HPO4濃度為0.6 g/mL時(shí)香菇多糖蛋白質(zhì)擁有最大的脫除率，可達(dá)87.84%。K2HPO4濃度超過0.6 g/mL時(shí)，隨著K2HPO4濃度的增加，脫除率反而下降，這是因?yàn)檫^高濃度的K2HPO4，導(dǎo)致了部分蛋白質(zhì)變性[19]。另外，處在下相的K2HPO4與位于上相的DES相互競(jìng)爭(zhēng)水分子，DES中的含水量逐漸下降，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的脫除率下降。在后續(xù)的單因素試驗(yàn)中，將K2HPO4的濃度確定為0.6 g/mL。

3.3.3 DES加入量對(duì)蛋白質(zhì)脫除率的影響

以DES1（物質(zhì)的量之比1∶2）與K2HPO4（0.6 g/mL，3 mL）構(gòu)建雙水相體系，香菇多糖水提液的加入量為2 mL，按照2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心萃取30 min，研究DES的加入量對(duì)雙水相體系中香菇多糖蛋白質(zhì)萃取行為的影響，數(shù)據(jù)處理結(jié)果如表4所示。

表4 DES加入量對(duì)E、Y的影響Table 4 Effect of DES addition on E and Y

由表4可知，當(dāng)DES的加入量在1.8 mL～2.6 mL范圍內(nèi)，隨著DES量的增加，香菇多糖蛋白質(zhì)的脫除率逐漸上升，這是因?yàn)镈ES簇集體的形成逐漸增多[13]，有利于蛋白質(zhì)的萃取。當(dāng)DES的加入量超過2.6 mL時(shí)，繼續(xù)增加DES的量，脫除率沒有明顯上升，所以在后續(xù)單因素試驗(yàn)中，DES的加入量為2.6 mL。

3.3.4 萃取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)脫除率的影響

以 DES 1（物質(zhì)的量之比 1 ∶2，2.6 mL）與 K2HPO4（0.6 g/mL，3 mL）構(gòu)建雙水相體系，向其中加入2 mL香菇多糖水提液，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速固定為2 000 r/min。研究離心萃取時(shí)間對(duì)雙水相體系中香菇多糖蛋白質(zhì)萃取行為的影響，數(shù)據(jù)處理結(jié)果和香菇多糖蛋白質(zhì)的脫除率隨萃取時(shí)間的變化關(guān)系如表5所示。

表5 萃取時(shí)間對(duì)E、Y的影響Fig.5 Effect of extraction time on E and Y

由表5可知，當(dāng)萃取時(shí)間由15 min增加到30 min時(shí)，香菇多糖蛋白質(zhì)的脫除率呈上升趨勢(shì)，繼續(xù)增加萃取時(shí)間，香菇多糖蛋白質(zhì)的脫除率E基本持平，未出現(xiàn)明顯增加，多糖回收率Y始終維持在較高水平。結(jié)果表明：萃取時(shí)間為30 mim時(shí)，香菇多糖蛋白質(zhì)幾乎萃取完全，繼續(xù)增加萃取時(shí)間，對(duì)提升脫除率無明顯影響。

3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以DES 1物質(zhì)的量比（A）、K2HPO4濃度（B）、DES加入量（C）、萃取時(shí)間（D）為因素，采用L9（34）正交進(jìn)行試驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)見表6，所得結(jié)果見表7。以蛋白質(zhì)脫除率為指標(biāo)，優(yōu)化萃取最佳工藝參數(shù)。

表6 正交試驗(yàn)因素水平表Table 6 Horizontal table of factors in orthogonal test

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 7 Orthogonal test results and analysis

由極差R分析可知，4個(gè)因素對(duì)香菇多糖蛋白質(zhì)脫除率的影響程度大小為：A（DES物質(zhì)的量比）＞C（DES量）＞B（無機(jī)鹽濃度）＞D（萃取時(shí)間）。氯化膽堿/丙三醇低共熔溶劑與K2HPO4組成的雙水相體系萃取香菇多糖蛋白質(zhì)最優(yōu)試驗(yàn)條件為A2B2C2D2，即DES物質(zhì)的量比 1 ∶2、0.6 g/mL K2HPO43 mL，2.6 mL DES，萃取時(shí)間30 min。

3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

在A2B2C2D2條件下進(jìn)行DES-K2HPO4雙水相體系脫除香菇多糖中蛋白質(zhì)的驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)Table 8 Demonstration test

據(jù)表8可知，在A2B2C2D2條件下蛋白質(zhì)平均脫除率高達(dá)90.8%，多糖平均回收率為98.0%。與表5在同等水平下所得脫除率及回收率相近，表明該條件下試驗(yàn)結(jié)果可靠。

3.6 香菇多糖DPPH自由基清除能力

香菇多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用見圖4。

圖4 香菇多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of lentinan on DPPH free radical

由圖4可知，在脫蛋白的香菇多糖水提液的質(zhì)量濃度為2.4 mg/mL時(shí)，隨著稀釋倍數(shù)的增大，DPPH自由基清除率逐漸減小，即在一定濃度范圍內(nèi)，DDPH自由基清除率隨著香菇多糖質(zhì)量濃度的增大而升高。

4 結(jié)論

本文通過熱水提取法制備香菇多糖溶液，采用低共溶劑（DES）-K2HPO4雙水相體系（ATPS）將香菇水提液中的多糖與蛋白質(zhì)進(jìn)行分離萃取研究，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，得出香菇多糖水提液蛋白質(zhì)脫除的最優(yōu)工藝參數(shù)：以氯化膽堿/丙三醇（物質(zhì)的量之比1 ∶2，2.6 mL）、K2HPO4（0.6 g/mL，3 mL） 構(gòu)建雙水相體系，加入2 mL香菇多糖水提液，萃取30 min后對(duì)香菇多糖蛋白質(zhì)的脫除率高達(dá)90.8%，香菇多糖回收率為98.0%。脫蛋白后的香菇多糖具有較好的清除能力，且清除能力隨著香菇多糖質(zhì)量濃度的增大而升高。

傳統(tǒng)脫蛋白的方法主要有sevag法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等，這類方法需消耗大量的有機(jī)溶劑，或需在低溫下進(jìn)行，對(duì)操作環(huán)境要求較高。而將DES與無機(jī)鹽構(gòu)成的雙水相體系，萃取溫度接近室溫20℃，操作條件簡(jiǎn)單，無污染，蛋白質(zhì)萃取率（脫除率）及多糖回收率均能達(dá)到較高的水平，是一種綠色的萃取方法。