吳雪嬌，吳艷，李旭嬌，郭銳，劉鑫，盛漪

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院上海食品安全工程技術(shù)研究中心，上海200240）

原花青素（Proanthocyanidin）是一類含雙黃酮衍生物的天然多酚類化合物的總稱，由兒茶素、表兒茶素和沒食子酸結(jié)合而成。原花青素中較多的酚羥基以及其特定的分子立體化學(xué)結(jié)構(gòu)、聚體之間的協(xié)同作用使其具有極強(qiáng)的抗氧化活性，是一種具有發(fā)展前景的化學(xué)抗氧化劑的替代品[1]。在醫(yī)藥領(lǐng)域，攝入原花青素不僅可以預(yù)防氧化應(yīng)激引起的疾病，如心血管疾病等，還可用于抗?jié)?、抗炎和抗癌[2]。但是，原花青素在應(yīng)用中存在一定的局限性，主要包括以下幾個(gè)方面：1）不適宜的風(fēng)味（苦澀味）；2）對(duì)環(huán)境條件（酸堿度、氧氣、溫度和光）敏感[3-4]；3）酚羥基結(jié)構(gòu)易于氧化；4）生物利用度低，半衰期短[5]。

納米載體系統(tǒng)可以用來(lái)提高原花青素的生物利用度，起到保護(hù)及靶向運(yùn)輸?shù)淖饔肹6-7]，充分發(fā)揮原花青素的抗氧化活性。自組裝技術(shù)是指在平衡條件下，兩親性聚合物通過非共價(jià)鍵作用，自發(fā)締結(jié)成熱力學(xué)穩(wěn)定、具有核殼結(jié)構(gòu)的納米粒的過程，它具有操作簡(jiǎn)便，不需要使用有機(jī)溶劑的優(yōu)勢(shì)。為了可以口服使用并盡量減少載體誘導(dǎo)的不良細(xì)胞毒性，食品級(jí)大分子是生物聚合物的最佳選擇，它們不僅具有生物降解性和生物相容性，而且還可以發(fā)揮特殊的生物功能。

酪蛋白是牛奶中的一種伸展性蛋白，其獨(dú)特的伸展結(jié)構(gòu)能夠平衡高凈電荷和低內(nèi)疏水性，與多酚的結(jié)合力強(qiáng)。但是酪蛋白在水中溶解性較低，酪蛋白-多糖自組裝接枝物與其構(gòu)造單元相比，具有更好的兩親性和表面活性作用[8]，可以抑制由于高濃度或與多酚相互作用而導(dǎo)致的相應(yīng)蛋白的沉淀，在多酚的包埋研究中發(fā)揮有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

目前，有關(guān)包埋水溶性物質(zhì)的納米顆粒制備的研究較少[9]。本文利用糖接枝的酪蛋白與原花青素進(jìn)行結(jié)合，構(gòu)建了一種納米復(fù)合物。以接枝度、褐變度和蛋白溶解度為指標(biāo)，對(duì)酪蛋白和麥芽糊精自組裝后的產(chǎn)物的物化性質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并通過紅外光譜和圓二色譜從微觀上分析蛋白和多糖之間結(jié)合的機(jī)制。以包埋率為指標(biāo)選擇最優(yōu)的原花青素納米復(fù)合物的構(gòu)建工藝，并對(duì)其進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白、硼酸鈉：上海泰坦科技股份有限公司；麥芽糊精、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、β-巰基乙醇、原花青素：上海麥克林生化科技有限公司；鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）：薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)（H2050R-1）：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)（BILON2000F）：上海比朗儀器制造有限公司；電子天平（PL 203）、pH 計(jì)（FE20）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；納米粒度-Zeta電位儀（NanoBrook Omni）：美國(guó)布魯克海文儀器公司；紫外分光光度計(jì)（UV-1810）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet 6700）：蘇州佐藤精密儀器有限公司；圓二色譜儀（J815）：日本JASOC公司；高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（Sirion 200）：美國(guó)FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白-麥芽糊精自組裝接枝物的制備

稱取質(zhì)量比1∶2的酪蛋白和麥芽糊精，酪蛋白濃度為10 mg/mL，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）溶解，磁力攪拌器攪拌均勻，25℃下水合24 h后，冷凍干燥。將凍干物碾碎，過80目篩，用帶孔的錫箔紙封好。在相對(duì)濕度79%、溫度60℃的條件下，使其在恒溫恒濕箱中反應(yīng)不同時(shí)間，得到自組裝接枝物，存放于4℃下備用。

1.3.2 酪蛋白-麥芽糊精自組裝接枝物的物化性質(zhì)研究

1.3.2.1 接枝度

蛋白與多糖的自組裝通過蛋白的ε-氨基和多糖的還原端羰基之間的共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行[10]，因此以氨基數(shù)目計(jì)算接枝度表示反應(yīng)進(jìn)行的程度。

OPA法[11]：OPA試劑為將40mg的OPA溶解于1mL甲醇中，加入2.5 mL0.2 g/mL SDS，25 mL 0.1 mol/L硼酸鈉及100 μL β-巰基乙醇，用去離子水定容至50 mL。測(cè)定時(shí)，取4 mL OPA試劑于試管中，加入樣品液200 μL，混勻后于40℃反應(yīng)2 min，在340 nm下測(cè)定其吸光值A(chǔ)t。在OPA溶液中加入200 μL去離子水代替樣品液作為空白對(duì)照A0。

接枝度計(jì)算公式：

式中：A0為未反應(yīng)時(shí)樣品的吸光度；At為反應(yīng)t時(shí)刻樣品的吸光度。

1.3.2.2 褐變度

取酪蛋白-麥芽糊精反應(yīng)產(chǎn)物，用去離子水溶解，配制為濃度10 mg/mL的均勻溶液，以去離子水作為空白對(duì)照，在420 nm處測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間下的吸光值，以吸光度的大小反應(yīng)其褐變程度。

1.3.2.3 蛋白溶解度

將接枝物溶解于不同pH值的磷酸鹽緩沖液中，調(diào)節(jié)pH值由3.0～7.0，10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min（4℃）。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中溶解的蛋白質(zhì)含量。

蛋白質(zhì)溶解度的計(jì)算公式[12]：

1.3.3 酪蛋白-麥芽糊精自組裝接枝物的表征

1.3.3.1 傅里葉-紅外光譜分析

分別稱取酪蛋白、麥芽糊精及接枝物適量（2 mg），以質(zhì)量比1∶50的量加入一定量的溴化鉀，待樣品和溴化鉀充分混合均勻后，壓成薄片，在400 cm-1～4 000 cm-1的波數(shù)范圍掃描。

1.3.3.2 圓二色譜分析

將接枝物溶于去離子水中，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度為0.1 mg/mL，在25℃下使用圓二色譜儀掃描分析蛋白質(zhì)樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。掃描波長(zhǎng)190 nm～250 nm，樣品池光程為10 mm，掃描速率100 nm/min，掃描步長(zhǎng)1.0 nm。每個(gè)樣品掃描3次，對(duì)光譜解析后計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量[13]。

1.3.4 原花青素納米復(fù)合物的制備

將一定量的原花青素溶于去離子水中，攪拌至全部溶解。將酪蛋白-麥芽糊精接枝物溶解于磷酸鹽緩沖液中，將原花青素溶液緩慢倒入接枝物混合溶液中，在常溫下攪拌均勻，-18℃下冷凍過夜后冷凍干燥，獲得納米復(fù)合物。

1.3.5 原花青素納米復(fù)合物構(gòu)建過程中單因素優(yōu)化

1.3.5.1 芯壁比

選定酪蛋白-麥芽糊精接枝物（酪蛋白/麥芽糊精質(zhì)量比1∶2，接枝時(shí)間15 h）濃度為10 mg/mL，磷酸鹽緩沖液pH 7.0，原花青素/接枝物的質(zhì)量比分別為1∶10、2 ∶10、3 ∶10、4 ∶10和 5 ∶10。

1.3.5.2 接枝物濃度

選定酪蛋白-麥芽糊精接枝物（酪蛋白/麥芽糊精質(zhì)量比 1 ∶2，接枝時(shí)間 15 h）濃度分別為 2.5、5、10、25、50 mg/mL，磷酸鹽緩沖液 pH 7.0，原花青素/接枝物的質(zhì)量比為2∶5。

1.3.5.3 接枝反應(yīng)時(shí)間

選定酪蛋白-麥芽糊精接枝物（酪蛋白/麥芽糊精質(zhì)量比 1 ∶2，接枝時(shí)間分別為 0、5、10、15、20、25 h）濃度為10 mg/mL，磷酸鹽緩沖液pH 7.0，原花青素/接枝物的質(zhì)量比為2∶5。

1.3.5.4 環(huán)境pH值

選定酪蛋白-麥芽糊精接枝物（酪蛋白/麥芽糊精質(zhì)量比為1∶2，接枝時(shí)間15 h）濃度為10 mg/mL，磷酸鹽緩沖液 pH 值分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 和 8.0，原花青素/接枝物的質(zhì)量比為2∶5。

納米復(fù)合物表面原花青素的測(cè)定：取1 g樣品加入45 mL無(wú)水乙醇，洗滌5 min后過濾，濾液移入50 mL容量瓶中，加入5 mL蒸餾水，用無(wú)水乙醇定容。取樣液0.5 mL，加入具塞試管，然后加入5 mL正丁醇-鹽酸（95∶5，體積比）溶液，封口，在90℃水浴中加熱2 h，于546 nm處測(cè)定吸光值。

納米復(fù)合物中總原花青素的測(cè)定：取1 g樣品放入研缽中，加5 mL蒸餾水研磨破壁，加入45 mL無(wú)水乙醇過濾，濾液移入50 mL容量瓶，用無(wú)水乙醇定容。取樣液0.5 mL，加入具塞試管，然后加入5 mL正丁醇-鹽酸（95∶5，體積比）溶液，封口，在90℃水浴中加熱2 h，于546 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.6 粒徑及電位分析

選擇配有He/Ne激光器（λ=633 nm）的Nano-Zs90馬爾文粒徑分析儀，散射角為90°。將待測(cè)樣品裝入聚苯乙烯比色皿中（折光指數(shù)1.33），測(cè)定溫度25℃，保溫3 min，記錄納米復(fù)合物的平均粒徑和多分散指數(shù)。采用Zeta-Nano分析儀對(duì)納米復(fù)合物的表面帶電情況進(jìn)行測(cè)量。

1.3.7 掃描電鏡觀察

將少量待檢測(cè)微粒涂抹于導(dǎo)電膠上，使用離子噴鍍儀噴金，噴金電流15 mA，噴鍍時(shí)間60 s，于10 kV電壓下觀察樣品。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用軟件SPSS處理數(shù)據(jù)，試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次取平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差（S.D.）。使用軟件Graphpad prism繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 自組裝接枝度的測(cè)定

蛋白與多糖自組裝所得兩親性生物聚合物的性質(zhì)受到多種因素影響。其中，接枝度直接反映了蛋白的糖基化程度，是接枝物最重要的理化性質(zhì)之一[14]。

Turan等[15]研究發(fā)現(xiàn)，乳清分離蛋白與葡聚糖的最佳接枝比為1∶3；Cheng等[16]試驗(yàn)證明，當(dāng)大米蛋白與葡聚糖的質(zhì)量比達(dá)到2∶1時(shí)，其接枝度最大，為22.98%。這表明，特定的蛋白質(zhì)和糖分子之間存在最適宜的質(zhì)量比使得其接枝度達(dá)到最大，適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量比既能增加反應(yīng)的速率，又能降低不期望反應(yīng)的發(fā)生。通過預(yù)試驗(yàn)，本試驗(yàn)選定酪蛋白/麥芽糊精的質(zhì)量比為1∶2。本試驗(yàn)研究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)自組裝所得接枝物的接枝度的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同反應(yīng)時(shí)間下接枝度的變化Fig.1 Changes of grafting degree under different reaction time

由圖1可知，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，接枝度隨之增加，25 h時(shí)，接枝度最大，為（50.16±0.90）%。反應(yīng)時(shí)間到達(dá)15 h后，接枝度變化不大（p＞0.05）。在此反應(yīng)過程中，接枝度增長(zhǎng)率的變化可能是因?yàn)樵诓煌磻?yīng)階段形成了不同的產(chǎn)物，不同產(chǎn)物的形成所需要的反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)物的濃度等因素有關(guān)，所以會(huì)導(dǎo)致接枝度的變化率的改變。Li等[12]利用D-葡萄糖、黃原膠與大豆分離蛋白結(jié)合發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間由6 h增加到24 h，其糖基化程度有所降低。導(dǎo)致這種不期望結(jié)果的原因可能是隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)之間的相互作用增加，與D-葡萄糖、黃原膠共同競(jìng)爭(zhēng)和大豆分離蛋白之間的結(jié)合位點(diǎn)，從而導(dǎo)致接枝度的降低[10]。所以，需要合理控制反應(yīng)的時(shí)間。

2.2 不同反應(yīng)時(shí)間下褐變度的變化

酪蛋白與麥芽糊精的自組裝反應(yīng)也是一種蛋白與多糖之間的干法美拉德反應(yīng)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酪蛋白-麥芽糊精接枝產(chǎn)物會(huì)發(fā)生褐變現(xiàn)象。美拉德濕法反應(yīng)一般較為徹底，褐變程度較嚴(yán)重，褐變指數(shù)最小一般在0.2左右，在反應(yīng)后期，會(huì)產(chǎn)生棕褐色物質(zhì)，即類黑精，而干法美拉德反應(yīng)的褐變程度較低。

不同反應(yīng)時(shí)間下，接枝物褐變程度的變化見圖2，不同反應(yīng)時(shí)間下產(chǎn)物顏色的變化見圖3。

圖2中，美拉德反應(yīng)時(shí)間在0～25 h之間時(shí)，褐變指數(shù)基本維持在0.25左右。圖3可以直觀的發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物的顏色呈現(xiàn)淡黃色。黃色可能是由于多糖的熱分解脫水（焦糖化）造成的[17]。麥芽糊精因?yàn)樵谄咸烟荂-4碳原子處具有羥基殘基，所以不容易發(fā)生Amadori反應(yīng)，使得其美拉德反應(yīng)能夠控制在初級(jí)階段，可以很好的控制美拉德產(chǎn)物的顏色，并防止后期有害大分子的生成，適合于食品工業(yè)的應(yīng)用。

圖2 不同反應(yīng)時(shí)間下褐變度的變化Fig.2 Changes of browning degree under different reaction time

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間下產(chǎn)物顏色的變化Fig.3 Change of product color under different reaction time

2.3 自組裝反應(yīng)對(duì)接枝物溶解度的影響

溶解性是蛋白的一個(gè)重要屬性，它可以影響蛋白的乳化性和凝膠性等其它特性。天然酪蛋白在其等電點(diǎn)附近凈電荷約為零，蛋白易沉淀。糖接枝蛋白自組裝反應(yīng)對(duì)接枝物溶解度的影響見圖4。

圖4 糖接枝蛋白自組裝反應(yīng)對(duì)接枝物溶解度的影響Fig.4 Effect of self-assembly of glycoprotein on solubility of graft copolymer

圖4顯示，當(dāng)酪蛋白與麥芽糊精進(jìn)行自組裝反應(yīng)后，其溶解度顯著提高。這是因?yàn)樵谧越M裝產(chǎn)物中，酪蛋白和麥芽糊精通過次級(jí)力形成較弱的復(fù)合物，暴露了更多的親水基團(tuán)，有利于蛋白的溶解。Jiménez-Casta?o等[18]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)-多糖結(jié)合物比蛋白質(zhì)本身具有更多的親水性基團(tuán)，與親水性多糖結(jié)合可提高蛋白質(zhì)與水分子的親和力，并在不利條件下限制蛋白質(zhì)的相互作用。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，后期可能會(huì)產(chǎn)生不溶性的聚合物，同時(shí)會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)，這些因素阻礙了接枝反應(yīng)的進(jìn)行，使得其溶解度不再變化或變化不明顯（p＜0.05）。

2.4 傅里葉-紅外光譜分析

測(cè)定蛋白、多糖及其接枝物的紅外光譜圖，分析其官能團(tuán)的特征吸收峰的變化。其中，酪蛋白的傅里葉-紅外光譜圖見圖5。

圖5 酪蛋白傅里葉-紅外光譜圖Fig.5 Fourier-infrared spectra of casein

圖5酪蛋白的特征譜中，顯示出較強(qiáng)的酰胺I、II、III帶，它們大致位于波數(shù)1 630 cm-1～1 680 cm-1、1 530 cm-1～1 560 cm-1、1 260 cm-1～1 420 cm-1之間[19]。酰胺 I帶是由肽鍵的C＝O伸縮振動(dòng)引起，酰胺II帶是C-N伸縮振動(dòng)以及N-H彎曲[20]。1 540 cm-1處的吸收峰是由酰胺II帶的-NH拉伸振動(dòng)引起。1 400 cm-1處的吸收峰是酰胺III帶的C-N振動(dòng)。1 250 cm-1的吸收峰屬于肽鍵的C-H拉伸振動(dòng)。

麥芽糊精的傅里葉-紅外光譜圖見圖6。

圖6 麥芽糊精傅里葉-紅外光譜圖Fig.6 Fourier-infrared spectra of maltodextrin

在圖6麥芽糊精的紅外光譜圖中，波數(shù)為1180 cm-1～953 cm-1的一系列重疊峰是由C-C、C-O、C-O-C的伸縮振動(dòng)和C-H的彎曲引起的[20]。

酪蛋白-麥芽糊精自組裝接枝物的傅里葉-紅外光譜圖見圖7。

圖7 酪蛋白-麥芽糊精自組裝接枝物傅里葉-紅外光譜圖Fig.7 Fourier-infrared spectra of casein-maltodextrin selfassembled grafts

在圖7酪蛋白-麥芽糊精接枝物的紅外光譜中，1 500 cm-1～1 700 cm-1左右的吸收峰主要是由酰胺I和II帶的C＝O伸縮振動(dòng)、C-N伸縮振動(dòng)提供。通過自組裝反應(yīng)后，1 500 cm-1～1 600 cm-1左右的吸收峰與酪蛋白相比明顯減弱，表明氨基數(shù)目減少。其次，1 000 cm-1～1 200 cm-1的吸收峰與麥芽糊精相比，發(fā)生偏移，表明酪蛋白和麥芽糊精反應(yīng)生成了新的官能團(tuán)[21]。

2.5 圓二色譜分析

對(duì)酪蛋白以及反應(yīng)后的蛋白接枝物進(jìn)行圓二色譜分析可以得到其在接枝過程中蛋白質(zhì)發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果見表1。

表1 酪蛋白及其接枝物的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 1 Protein secondary structure analysis of casein and its graft %

由表1可知，當(dāng)酪蛋白與麥芽糊精進(jìn)行自組裝后，其α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角都有所減少，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的α-螺旋、β-折疊一般埋在多肽鏈的內(nèi)部，加熱以及大分子之間的相互作用使得酪蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。反應(yīng)后無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的增加有利于分子間氫鍵的形成和疏水氨基酸殘基的暴露。這與Feng等[22]使用美拉德反應(yīng)制備大豆分離蛋白-麥芽糊精接枝物和大豆分離蛋白-阿拉伯膠接枝物測(cè)出的接枝物的圓二色譜結(jié)果類似。但是略有不同的是，其試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白-麥芽糊精接枝物的無(wú)規(guī)則卷曲率大于其混合物的無(wú)規(guī)則卷曲率，而本試驗(yàn)中，酪蛋白-麥芽糊精接枝物的無(wú)規(guī)則卷曲的比例與其混合物相比，略有減少，造成這種現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)酪蛋白和麥芽糊精發(fā)生接枝反應(yīng)后，雖然部分酪蛋白的肽鏈被打開，其結(jié)構(gòu)得到伸展，但是由于酪蛋白的氨基與多糖的羰基相結(jié)合，使得其二級(jí)結(jié)構(gòu)變得更穩(wěn)定，所以本試驗(yàn)獲得其無(wú)規(guī)則卷曲的比例略微減小的結(jié)果。

2.6 反應(yīng)參數(shù)對(duì)原花青素包埋率的影響

2.6.1 芯壁比對(duì)包埋率的影響

根據(jù)試驗(yàn)得到的不同芯壁比對(duì)包埋率的影響見圖8。

圖8 芯壁比對(duì)包埋率的影響Fig.8 Effect of core-wall ratio on encapsulation efficiency

圖8顯示，當(dāng)原花青素的濃度較低時(shí)，麥芽糊精對(duì)酪蛋白存在空間位阻效應(yīng)[23]，阻礙了原花青素與蛋白的接觸，包埋率較低。隨著芯壁比的增加，可以與酪蛋白-麥芽糊精接枝物結(jié)合的原花青素增加，其包埋率也隨之增加。當(dāng)原花青素的濃度較大時(shí)，多余的原花青素不能完全被糖基化酪蛋白結(jié)合，暴露在納米顆粒表面，導(dǎo)致包埋率的降低。Liu等[24]使用殼聚糖/磺丁基-β-環(huán)糊精包埋茶多酚發(fā)現(xiàn)，當(dāng)茶多酚的濃度由1 mg/mL增加到3 mg/mL時(shí)，其包埋率減小，這主要是因?yàn)殡S著茶多酚質(zhì)量比的增加，殼聚糖/磺丁基-β-環(huán)糊精的基質(zhì)達(dá)到飽和，導(dǎo)致多余的茶多酚附著在其表面或游離于溶液中，所以包埋率減小。

2.6.2 接枝物濃度對(duì)包埋率的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得到接枝物濃度對(duì)包埋率的影響見圖9。

圖9 接枝物濃度對(duì)包埋率的影響Fig.9 Effect of graft concentration on encapsulation efficiency

圖9顯示，隨著接枝物濃度的增加（2.5 mg/mL～25 mg/mL），對(duì)原花青素的包埋率也隨之增加。這是因?yàn)殡S著接枝物濃度的提高，更多的接枝物可以與原花青素之間通過疏水相互作用、氫鍵作用自組裝形成納米粒子。此外，由于多糖分子的存在，會(huì)形成一定的空間位阻，使得酪蛋白的分子結(jié)構(gòu)更加分散，接觸面積有所增加，促使其更容易與原花青素進(jìn)行結(jié)合[25]。當(dāng)可以與原花青素進(jìn)行反應(yīng)的接枝物的數(shù)量達(dá)到最大值后，接枝物濃度進(jìn)一步增大（25 mg/mL～50 mg/mL），蛋白分子之間易發(fā)生相互作用，形成聚集體，從而使得酪蛋白-麥芽糊精接枝物與原花青素之間的結(jié)合受阻，包埋率降低。

2.6.3 接枝時(shí)間對(duì)包埋率的影響

圖10反應(yīng)了接枝時(shí)間對(duì)包埋率的影響。

圖10 接枝反應(yīng)時(shí)間對(duì)包埋率的影響Fig.10 Effect of grafting reaction time on encapsulation efficiency

由圖10可知，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，麥芽糊精和酪蛋白之間逐漸形成穩(wěn)定的核殼結(jié)構(gòu)，能夠更好地包埋原花青素，其包埋率得以增加。但是，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，反應(yīng)后期會(huì)生成一些不期望的物質(zhì)，一方面，這些物質(zhì)可能易分解、不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致更多的原花青素分散在接枝物的表面，其包埋率降低；另一方面，某些聚合物的生成會(huì)使得酪蛋白-麥芽糊精對(duì)原花青素的結(jié)合作用受到阻滯，導(dǎo)致包埋率的降低。

2.6.4 環(huán)境pH值對(duì)包埋率的影響

原花青素作為一種多酚化合物，對(duì)環(huán)境pH值較敏感，此外，溶液pH值對(duì)酪蛋白的溶解度也具有一定影響。環(huán)境pH值對(duì)包埋率的影響見圖11。

圖11 環(huán)境pH值對(duì)包埋率的影響Fig.11 Effect of environmental pH on encapsulation efficiency

由圖11可以看出，當(dāng)酪蛋白自組裝產(chǎn)物的溶液pH值控制在6～8之間時(shí)，其包埋率基本穩(wěn)定不變。酪蛋白的等電點(diǎn)為pH 4.6左右，當(dāng)溶液pH值在其等電點(diǎn)附近時(shí)，酪蛋白的溶解度較低，這時(shí)它表現(xiàn)為電中性，導(dǎo)致接枝物對(duì)原花青素的包埋率也較低。Pulicharla等[26]采用草莓多酚和殼聚糖反應(yīng)結(jié)合，發(fā)現(xiàn)在pH4.0時(shí)，殼聚糖中的羥基呈現(xiàn)出對(duì)草莓多酚排斥的負(fù)電荷，因此，水溶性的草莓多酚和殼聚糖之間的相互作用減弱，包埋率降低。當(dāng)進(jìn)入堿性環(huán)境后，蛋白分子多以無(wú)規(guī)則線團(tuán)形式存在，使得其與多酚之間能形成穩(wěn)定的納米粒子[27]，包埋率也因之較為穩(wěn)定。當(dāng)環(huán)境pH值達(dá)到6.0后，其對(duì)包埋率影響不顯著（p＞0.05），所以，后續(xù)試驗(yàn)選擇pH 7.0作為環(huán)境pH值。

2.7 正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇芯壁比、接枝時(shí)間、接枝物濃度作為變量，如表2所示設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)對(duì)制備條件進(jìn)行優(yōu)化。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels graph

正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 正交優(yōu)化試驗(yàn)Table 3 Orthogonal optimization test

續(xù)表3 正交優(yōu)化試驗(yàn)Continue table 3 Orthogonal optimization test

由表3可知，此三因素對(duì)包埋率的影響顯著程度為：芯壁比＞接枝時(shí)間＞接枝物濃度。K值最佳的包埋條件為：芯壁質(zhì)量比2∶5，接枝時(shí)間15 h，接枝物濃度25 mg/mL。對(duì)理論最佳制備參數(shù)A2B2C3進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)得出，在此條件下制備得到的原花青素包埋率為93.48%，大于正交試驗(yàn)的最大包埋率93.17%，說(shuō)明最佳制備參數(shù)A2B2C3確為最優(yōu)。

2.8 原花青素納米復(fù)合物的表征

本試驗(yàn)構(gòu)建獲得原花青素納米復(fù)合物的平均粒徑為（158.69±1.70）nm，PDI為 0.189±0.005，Zeta電位為（-30.58±1.27）mV，包埋率為（93.48±0.20）%。酪蛋白-麥芽糊精原花青素納米復(fù)合物的粒徑分布見圖12。

圖12 酪蛋白-麥芽糊精原花青素納米復(fù)合物的粒徑分布Fig.12 Particle size distribution of casein-maltodextrin proanthocyanidin nanocomposites

圖12顯示了原花青素納米復(fù)合物的粒徑分布情況，可以看到其粒徑主要集中在200 nm左右，分布較均勻。Liu等[24]分別將酪蛋白與原花青素溶于去離子水中，小麥醇溶蛋白和原花青素溶于乙醇溶液中，制備得到兩種納米復(fù)合物。當(dāng)選定蛋白與原花青素的質(zhì)量比為1∶0.5時(shí)，酪蛋白-原花青素納米復(fù)合物的粒徑為140 nm，而小麥醇溶蛋白-原花青素納米復(fù)合物的粒徑為212 nm，其包埋率分別約為55%和45%，Zeta電位分別約為-15 mV和-10 mV。Yin等[28]采用逆向蒸發(fā)法和超聲處理相結(jié)合，將大豆卵磷脂-膽固醇與原花青素結(jié)合制備成納米脂質(zhì)體，其最高包埋率為（71.97±0.42）%。Tie等[29]以原花青素為芯材，以阿拉伯膠和β-環(huán)糊精為壁材，采用高壓微射流技術(shù)結(jié)合噴霧干燥制備得到原花青素乳液及其微膠囊，其包埋率為（88.60±0.3）%，在最佳條件下制備得到微膠囊的Zeta電位為（12.13±0.12）mV。相比而言，本試驗(yàn)構(gòu)建的原花青素納米復(fù)合物的包埋率和Zeta電位的絕對(duì)值都顯著較大。由結(jié)果可知，蛋白/多糖的結(jié)合與其構(gòu)成物相比，能夠顯著提高原花青素的包埋率，這主要是因?yàn)槔业鞍着c麥芽糊精接枝使得納米復(fù)合物中形成一定的空間位阻，增加了原花青素與自組裝接枝物的結(jié)合位點(diǎn)，此外，親水的多糖鏈可以通過氫鍵等作用力與水分子進(jìn)行結(jié)合構(gòu)成外殼結(jié)構(gòu)，酪蛋白的疏水基團(tuán)可以通過疏水相互作用形成疏水微區(qū)，進(jìn)一步包埋原花青素，從而提高其包埋率。納米顆粒的穩(wěn)定性依賴于納米顆粒相互靠近時(shí)其間排斥力和吸引力的平衡。Zeta電位絕對(duì)值越高，即排斥力大于吸引力，體系越穩(wěn)定。所以本試驗(yàn)構(gòu)建的納米復(fù)合物具有更好的穩(wěn)定性。

2.9 原花青素納米復(fù)合物的掃描電鏡分析

對(duì)酪蛋白-麥芽糊精接枝物及原花青素納米復(fù)合物的表觀形態(tài)利用掃描電鏡進(jìn)行觀察，可以發(fā)現(xiàn)結(jié)果如圖13和圖14所示。

圖14 酪蛋白-麥芽糊精原花青素納米復(fù)合物的掃描電鏡圖Fig.14 Scanning electron microscopy of casein-maltodextrin proanthocyanidin nanocomposites

從圖13和圖14中可以發(fā)現(xiàn)酪蛋白-麥芽糊精反應(yīng)接枝物形成了具有小孔、裂縫和褶皺的片狀物，這可能是由于冷凍干燥使得其表面及內(nèi)部水分蒸發(fā)，形成多孔的結(jié)構(gòu)。而原花青素納米復(fù)合物則呈現(xiàn)一種有規(guī)律的具有光滑表面的緊湊的球狀結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)樵ㄇ嗨啬芴顫M基質(zhì)的空腔，導(dǎo)致多孔性降低，使得其表面也更加光滑[30]。

3 結(jié)論

本文主要研究酪蛋白與麥芽糊精自組裝反應(yīng)中的理化性質(zhì)及作用機(jī)制，并確定原花青素和酪蛋白-麥芽糊精自組裝接枝物形成納米復(fù)合物的最佳條件，以包埋率為指標(biāo)，優(yōu)化納米復(fù)合物形成過程中的條件。確定構(gòu)建的最佳工藝參數(shù)：酪蛋白/麥芽糊精質(zhì)量比1∶2；接枝反應(yīng)時(shí)間15 h；原花青素/接枝物質(zhì)量比2∶5；接枝物濃度25 mg/mL；溶液pH 7.0。在最佳工藝條件下，其包埋率達(dá)到93.48%，平均粒徑為158.69 nm，Zeta電位為-30.58 mV，所得納米復(fù)合物呈現(xiàn)光滑緊湊的球狀結(jié)構(gòu)。綜上，本試驗(yàn)通過將蛋白與多糖自組裝形成的兩親性生物聚合物與原花青素結(jié)合構(gòu)建了一種穩(wěn)定的納米復(fù)合物，為生物活性化合物的載運(yùn)開辟了一條新途徑，其在功能性食品和藥品的應(yīng)用中具有廣闊的發(fā)展前景。