文 程,王 薇
(1.大慶醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,黑龍江 大慶 163312;2.大慶油田總醫(yī)院,黑龍江 大慶 163111)
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤,在膠質(zhì)瘤中約占50%[1],其呈浸潤性生長,具有高復(fù)發(fā)率、高死亡率的特點(diǎn)。手術(shù)很難完全切除,且對化、放療具有明顯的抵抗性。GBM 患者經(jīng)過治療后的平均生存時間僅為14.6個月[2],因此迫切需要尋找新的有效治療膠質(zhì)瘤的藥物。
凋亡素(Apoptin)是來自雞貧血病毒的蛋白質(zhì),已經(jīng)證實(shí)其具有誘導(dǎo)包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞在內(nèi)的70多種腫瘤細(xì)胞凋亡,并且無化療耐藥性的特點(diǎn),被視為“抗腫瘤明星分子”[3]。凋亡素通過下調(diào)HSP70促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和誘發(fā)有絲分裂災(zāi)變[4]。但凋亡素是大分子蛋白質(zhì),到體內(nèi)后可能會產(chǎn)生一定的免疫原性而導(dǎo)致一定的副反應(yīng),因此,試想如果對凋亡素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,利用其發(fā)揮效應(yīng)的序列構(gòu)建一分子多肽片段,即凋亡素衍生肽,可能會起到更好的抗腫瘤效果,而且極大減少其對機(jī)體免疫原性反應(yīng)。
本研究在確定HSP70在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)的基礎(chǔ)上,通過蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用對凋亡素分子序列進(jìn)行分析,構(gòu)建出凋亡素衍生肽(ADP),并證實(shí)ADP能夠通過下調(diào)HSP70的表達(dá)而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和生長,并證明該凋亡素衍生肽的作用優(yōu)于凋亡素以及常規(guī)化療藥物,進(jìn)而為進(jìn)一步開發(fā)治療GBM的藥物,提供有力依據(jù)。
人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG和U251-MG,GEM患者標(biāo)本,多肽,質(zhì)粒。
1.2.1 通過對照實(shí)驗,利用Western印跡分析、免疫組化、RT-PCR技術(shù)證實(shí)HSP70在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)均高于正常組織細(xì)胞。
1.2.2 利用蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用確定的凋亡有效片段,構(gòu)建出了凋亡素衍生肽(ADP),并對其作用進(jìn)行評估;利用分析軟件對ADP的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,證實(shí)該衍生肽片段與理論值一致。
1.2.3 通過對ADP與凋亡素、常規(guī)化療藥物導(dǎo)致GBM細(xì)胞凋亡的比照分析,證實(shí)ADP促進(jìn)GBM細(xì)胞凋亡程度更大。
1.2.4 通過ADP治療組和未治療組的HSP70表達(dá)下調(diào)程度與細(xì)胞核凋亡程度的分析,證實(shí)了ADP可通過降低HSP70的表達(dá)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。
Western-blotting分析結(jié)果顯示了GBM中HSP70的表達(dá)高出正常腦組織(NBT)的3倍(圖1)。免疫組化結(jié)果顯示HSP70表達(dá)在膠質(zhì)瘤中顯著增加(圖2)。qRT-PCR分析結(jié)果結(jié)果顯示HSP70在膠質(zhì)瘤組織中和GBM細(xì)胞中的表達(dá)與NBT相比顯著增加(圖3)。同時也由此得出,U87-MG和U251-MG能夠作為本研究中GMB細(xì)胞的合適模型。
圖1
圖2
圖3
通過系列分析,篩選出凋亡素衍生肽有效序列,并構(gòu)建出ADP,并通過體外pull-down測定裂解物、免疫共沉淀分析與免疫熒光分析證實(shí)其與HSP70間的相互作用。結(jié)果表明ADP多肽可以有效降低HSP70在細(xì)胞中的表達(dá)。利用分析軟件對ADP的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果表明其與理論值的一致。
比較ADP-未處理和ADP處理的293和U87 - MG細(xì)胞的核蛋白的凋亡程度,進(jìn)行核凋亡分析。Western blotting和免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié)果均表明HSP70被表達(dá)。從細(xì)胞核形態(tài)顯示ADP治療組導(dǎo)致的凋亡更為明顯,表明ADP具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)U-87細(xì)胞凋亡的能力。
本研究為進(jìn)一步尋求確定最短的序列凋亡素可以促進(jìn)HSP70下調(diào),并模擬凋亡素的抑制活性,在對凋亡素序列分析的基礎(chǔ)上,除去了NES(氨基酸:97-105)結(jié)構(gòu)域并保留了NLS1和NLS2結(jié)構(gòu)域,由LRS連接,并在N上添加了一個TAT序列該肽的末端用作標(biāo)簽,進(jìn)而構(gòu)建出凋亡素衍生肽ADP。通過一系列實(shí)驗證明了ADP保留絕大多數(shù)抗腫瘤特異性靶標(biāo)的凋亡素的功能,其抑制GBM細(xì)胞中的HSP70轉(zhuǎn)錄并發(fā)揮的作用比凋亡素在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中的作用更強(qiáng)。因此,研究結(jié)果表明合成凋亡肽衍生肽具有較好的抑制GMB生長和侵襲作用。此外,鑒于HSP70在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)[5],因此ADP似乎可以作為理想的藥物用于GMB的治療,由此為GBM的治療提供了一種新的思路。