葛 雷，李 垚，戴建軍，姚惠娟，張樹(shù)山，2，張德福，2

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106；2 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室，上海201106；3 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；4 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海200025)

葛雷，李垚，戴建軍，等.抑制素免疫對(duì)崇明白山羊公羔羊生殖發(fā)育的影響[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，36(4)：71-76

抑制素(Inhibin，INH)是一種由動(dòng)物性腺分泌的糖蛋白激素，主要來(lái)源于睪丸支持細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞，可特異性作用于垂體，對(duì)基礎(chǔ)的卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)分泌和促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)刺激的FSH 分泌有抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系[1-2]。 抑制素還可以通過(guò)自分泌和旁分泌途徑直接作用于性腺而影響其功能[1]。 抑制素的分泌對(duì)維持睪丸正常生理功能起著重要作用，可以調(diào)節(jié)精子的發(fā)育和成熟。 抑制素免疫作為一種新型可增強(qiáng)動(dòng)物繁殖性能的方法，可以中和動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源性抑制素，減弱內(nèi)源性抑制素對(duì)FSH 的抑制作用，從而達(dá)到促進(jìn)FSH 分泌的效果。 抑制素免疫在促進(jìn)雌性動(dòng)物排卵及提高胚胎質(zhì)量、增加產(chǎn)仔數(shù)上等方面的研究已取得重大成果[3-5]。

抑制素免疫的相關(guān)研究主要集中在其促進(jìn)雌性動(dòng)物排卵等方面，而對(duì)雄性動(dòng)物生殖方面的影響研究相對(duì)較少，且研究結(jié)果存在差異[5]。 本試驗(yàn)采用抑制素主動(dòng)免疫崇明白山羊雄性斷奶羔羊，研究其對(duì)公羔羊體重、睪丸發(fā)育及激素水平等方面的影響，以期為抑制素免疫在雄性動(dòng)物生殖中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院草食動(dòng)物試驗(yàn)站，選取12 頭健康、斷奶的雄性崇明白山羊羔羊進(jìn)行試驗(yàn)，平均體重(15.25 ±2.22)kg，平均年齡(113.0 ±2.5)d。 隨機(jī)分為對(duì)照組和免疫試驗(yàn)組，每組6 頭。

1.2 免疫流程及樣品采集

重組抑制素油乳劑由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院施振旦教授饋贈(zèng)。 免疫時(shí)，對(duì)免疫組羔羊頸部肌肉注射含重組抑制素的油乳劑疫苗，劑量為1 mL∕只，抑制素質(zhì)量濃度為1 mg∕mL，注射當(dāng)天記為第0 天。 在第21 天、第42 天、第63 天共進(jìn)行3 次加強(qiáng)免疫。 對(duì)照組注射不含重組抑制素的油乳劑，注射劑量、時(shí)間及部位與免疫組相同。

在第0 天、第21 天、第42 天、第63 天及第84 天測(cè)量動(dòng)物的體重(Body weight，BW)及陰囊(Scrotum circumference，SC)周長(zhǎng)。 在第0 天、第21 天、第28 天、第42 天、第56 天、第63 天、第70 天、第77 天及第84 天頸靜脈采血，血液靜置6 h 后1 500 ×g離心15 min，收集血清，-80 ℃保存待測(cè)。

第84 天，閹割試驗(yàn)羊，睪丸用生理鹽水清洗，清除附帶組織后稱取睪丸質(zhì)量(Testes weight，TW)。 切取適當(dāng)大小的睪丸組織放入mDF 固定液中用于石蠟切片制作，部分組織裝入冷凍管，投入液氮中用于組織RNA 提取。

1.3 抑制素抗體檢測(cè)

抑制素抗體濃度用山羊抑制素α 抗體(Inhibin-α)ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。 試劑盒為卡邁舒(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 睪丸組織切片及分析

睪丸組織石蠟切片及HE(Hematoxylin-eosin staining)染色委托上海長(zhǎng)海醫(yī)院進(jìn)行。 拍照后選取免疫組和對(duì)照組睪丸切片中形態(tài)完整、形狀較規(guī)則的生精小管切面，用Image-Pro Express 6.0 測(cè)量其管腔面積相對(duì)大小。 挑選免疫組和對(duì)照組管腔面積相近的生精小管，用Image-Pro Express 6.0 測(cè)定單個(gè)生精細(xì)管切面中精子細(xì)胞、支持細(xì)胞、精原細(xì)胞及管腔周圍間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。

1.5 激素水平檢測(cè)

FSH、黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)、睪酮(Testosterone，T)的濃度分別用Goat FSH ELISA Kit、Goat LH ELISA Kit 和Goat T ELISA Kit 進(jìn)行檢測(cè)。 試劑盒均為上海潤(rùn)裕生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.6 生殖相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

1.6.1 總RNA 的提取

采用北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TransZol Up Plus RNA Kit 提取睪丸組織總RNA。 所提取的RNA 的OD260nm∕OD280nm為1.8—2.0。

1.6.2 cDNA 的制備

使用北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TransScript ⅡOne-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.6.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)

按照北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TransStart Top Green qPCR SuperMix 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)，以1 μL cDNA、F∕R 引物各0.4 μL、2 ×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、ddH2O 8.2 μL 構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，在Roche Light Cycler96 儀器上檢測(cè)。 以GAPDH為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt計(jì)算免疫組內(nèi)基因相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)水平，比較兩組間的差異。 qRT-PCR 的引物序列及相應(yīng)退火溫度(Tm)見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 引物序列及退火溫度(Tm)Table 1 Primer sequences and annealing temperature(Tm)of qRT-PCR

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，組間差異用方差分析法，P＜0.05或P＜0.01 表示差異顯著或極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制素抗體水平

如圖1 所示，從第21 天開(kāi)始，免疫組動(dòng)物血清抗體濃度顯著或極顯著高于對(duì)照組。 整個(gè)試驗(yàn)期間，免疫組抑制素抗體水平均顯著高于對(duì)照組。

2.2 抑制素免疫對(duì)體重、陰囊周長(zhǎng)及睪丸質(zhì)量的影響

從表2 可以看出，從第21 天開(kāi)始，免疫組動(dòng)物的體重增長(zhǎng)速度較對(duì)照組變緩，但兩組之間并無(wú)顯著差異。第42 天起，免疫組動(dòng)物陰囊周長(zhǎng)增長(zhǎng)速度較之前變緩，并且在第63 天開(kāi)始低于對(duì)照組，但兩組之間無(wú)顯著差異。

表2 免疫組和對(duì)照組動(dòng)物體重及陰囊周長(zhǎng)變化Table 2 Changes of BW and SC in immunized group and control group

由表3 可以看出，在試驗(yàn)第84 天，免疫組動(dòng)物陰囊周長(zhǎng)、睪丸質(zhì)量及體重與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異，動(dòng)物睪丸質(zhì)量和體重比值也無(wú)顯著差異。

表3 第84 天陰囊周長(zhǎng)、睪丸質(zhì)量、動(dòng)物體重及睪丸質(zhì)量/體重的比值Table 3 SC,TW,BW and TW/BW ratio of Chongming white goat on the 84th day

2.3 睪丸組織切片

如圖2 所示，免疫組和對(duì)照組白山羊睪丸組織形態(tài)學(xué)上并沒(méi)有顯著的差異，生精小管內(nèi)壁光滑，管腔內(nèi)均可見(jiàn)精子細(xì)胞。 比較免疫組和對(duì)照組的睪丸生精小管的管腔切面面積，發(fā)現(xiàn)兩者沒(méi)有顯著差異，管腔切面內(nèi)精子細(xì)胞、支持細(xì)胞、精原細(xì)胞及管腔周圍的間質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)也沒(méi)有顯著差異(表4)。

表4 單個(gè)生精小管管腔切面相對(duì)面積及其內(nèi)精子細(xì)胞、支持細(xì)胞、精原細(xì)胞和周圍間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量Table 4 The relative lumen area of single seminiferous tubule and the number of spermatocytes,sertoli cells,spermatogonia and peripheral stromal cells in a single seminiferous tubule

2.4 抑制素主動(dòng)免疫對(duì)崇明白山羊公羔羊體內(nèi)激素分泌的影響

如圖3 所示，免疫后，免疫組FSH 及T 激素水平有上升趨勢(shì)，在二免后7 d，即第28 天達(dá)到峰值，并顯著高于對(duì)照組。 在三免(第42 天)后，即第42—56 天，免疫組FSH 及T 激素水平也有上升趨勢(shì)，但與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異。 之后，兩組FSH 和T 水平呈波動(dòng)變化，無(wú)顯著差異。

抑制素主動(dòng)免疫崇明白山羊?qū)ζ銵H 的分泌并無(wú)顯著影響。 二免、三免后免疫組LH 激素水平有小幅上升趨勢(shì)，但與對(duì)照組無(wú)顯著差異。

2.5 抑制素主動(dòng)免疫對(duì)崇明白山羊公羔羊生殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖4 所示，免疫組試驗(yàn)羊睪丸組織染色體聯(lián)會(huì)相關(guān)基因Dmrtc2 基因表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(3.04 vs 1.00)；性腺發(fā)育相關(guān)基因SOX30 表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(1.48 vs 1.00)；雄激素受體基因AR表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(0.59 vs 1.00)。 而免疫組和對(duì)照組之間FSHR(FSH 受體基因)、LHR(LH 受體基因)、GPx4(精子發(fā)生相關(guān)基因)以及DDX4(減數(shù)分裂相關(guān)基因)表達(dá)量?jī)山M之間沒(méi)有顯著差異(1.03 vs 1.00；1.02 vs 1.00；0.83 vs 1.00；0.81 vs 1.00)。

3 討論與結(jié)論

抑制素是一種主要來(lái)源于雄性動(dòng)物睪丸支持細(xì)胞和雌性動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞的糖蛋白激素，其主要生理作用是與激活素共同調(diào)控FSH 的合成與分泌[6]。 在雄性動(dòng)物體內(nèi)，抑制素主要來(lái)源于睪丸，而睪丸以外的副性腺等部位也能分泌低濃度抑制素，并可能通過(guò)自分泌或旁分泌的形式發(fā)揮作用，與睪酮共同抑制FSH 的分泌，對(duì)精子發(fā)生等方面進(jìn)行調(diào)控，從而影響公畜繁殖力[7-9]。

抑制素對(duì)FSH 具有反饋性抑制作用，抑制素免疫可以降低動(dòng)物內(nèi)源性抑制素水平，從而解除抑制素對(duì)FSH 的抑制作用，達(dá)到提高FSH 水平的效果，從而增加雌性動(dòng)物卵泡數(shù)量，提高排卵率[10-12]。 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制素免疫可以顯著提高崇明白山羊體內(nèi)抑制素抗體水平。 抑制素免疫對(duì)雄性動(dòng)物的相關(guān)研究結(jié)果并不一致，有研究表明抑制素免疫有利于提高牛及山羊的精子數(shù)量、精子密度及活力，降低精子畸形率，從而提高繁殖力[13]；但Voge 等[14-15]在6 月齡公羔羊上的研究發(fā)現(xiàn)，抑制素免疫對(duì)羔羊體重、陰囊周長(zhǎng)及睪丸質(zhì)量均沒(méi)有顯著影響，對(duì)血清FSH、LH 和T 水平也沒(méi)有顯著影響，本試驗(yàn)結(jié)果與其基本一致。 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二免后免疫組血清FSH 及T 水平較對(duì)照組出現(xiàn)短暫顯著上升現(xiàn)象，而其余時(shí)間點(diǎn)FSH 及T 水平兩組之間并沒(méi)有顯著差異，可能是由于抑制素免疫降低內(nèi)源性抑制素水平，從而提高了FSH 水平；T 升高的原因可能是由于在內(nèi)源性抑制素水平降低后，T 需要增強(qiáng)其對(duì)FSH 的抑制作用；抑制素疫苗注射或免疫后，重復(fù)免疫可造成動(dòng)物對(duì)疫苗的敏感性降低，無(wú)法起到降低內(nèi)源性抑制素水平的效果，故免疫后期FSH 水平并沒(méi)有顯著上升。

Dmrtc2 基因又名Dmrt7 基因，作為Dmrt 基因家族中重要的一員，其只在哺乳動(dòng)物性腺中存在并表達(dá)，在減數(shù)分裂粗線期和雙線期之間雄性特有的性染色體聯(lián)會(huì)過(guò)渡中扮演關(guān)鍵角色[16-18]，故Dmrtc2 基因在精子發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。SOX30 基因是SOX核轉(zhuǎn)錄因子基因超家族成員，在整個(gè)動(dòng)物界普遍存在，其主要在睪丸生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞中表達(dá)，可能參與了性腺發(fā)育、精原細(xì)胞分化和精子形成過(guò)程[19]。本試驗(yàn)顯示，免疫組睪丸內(nèi)Dmrtc2 基因和SOX30 基因表達(dá)水平分別極顯著和顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明抑制素對(duì)公羔羊性腺及精子的發(fā)生、發(fā)育有促進(jìn)作用。 雄激素受體(AR)作為雄激素發(fā)揮生理作用的重要載體，其基因水平限制雄激素的生理功能，從而影響動(dòng)物性生理的發(fā)育[20]。 然而本試驗(yàn)顯示，免疫組AR基因的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，表明抑制素免疫對(duì)公羔羊發(fā)育起一定抑制作用，相關(guān)原因仍需進(jìn)一步研究闡明。 FSH 和LH 需要分別通過(guò)各自受體基因FSHR和LHR方能發(fā)揮其生理功能[21]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)免疫組和對(duì)照組間FSHR和LHR基因表達(dá)水平并無(wú)顯著差異，說(shuō)明抑制素免疫并不通過(guò)影響FSH 和LH 的分泌來(lái)影響公羔羊生殖發(fā)育。GPx4 基因是GPxs家族的成員，其在睪丸中高度表達(dá)并在精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22]。DDX4 基因是DEAD-box基因家族的重要成員，在哺乳動(dòng)物中僅在生殖細(xì)胞系中特異性表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物是精子發(fā)生的必需蛋白，與精子發(fā)生減數(shù)分裂密切相關(guān)[23]。 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制素免疫不會(huì)影響GPx4 和DDX4 基因的表達(dá)水平。

此外，對(duì)睪丸組織石蠟切片的觀察發(fā)現(xiàn)，免疫組和對(duì)照組睪丸組織在結(jié)構(gòu)上并沒(méi)有明顯差異，生精小管管腔面積、管腔內(nèi)各種細(xì)胞的數(shù)量均沒(méi)有顯著差異。 抑制素免疫對(duì)公羔羊生殖系統(tǒng)的影響是相當(dāng)復(fù)雜的，很可能是促進(jìn)與抑制的共同作用，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上，抑制素免疫雖可以顯著提高崇明白山羊雄性斷奶羔羊血清抑制素抗體水平、睪丸Dmrtc2 和SOX30 基因的表達(dá)水平，降低睪丸AR基因的表達(dá)水平，并在二免后短暫提高血清FSH 及T 激素水平，但并不影響體重、陰囊周長(zhǎng)、睪丸大小及組織結(jié)構(gòu)、睪丸FSHR、LHR、GPx4 及DDX4 基因的表達(dá)水平。