胡 蘭，孫雙燕，曹偉召，曾文秀，趙國超，李建粵?

(1 上海師范大學生命科學院，上海200234；2 上海上實現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，上海202183)

胡蘭，孫雙燕，曹偉召，等.利用分子標記輔助選育優(yōu)質(zhì)長粒香型軟米水稻新品系“上師大19 號”[J].上海農(nóng)業(yè)學報，2020，36(4)：1-5

近年來，改善稻米食味品質(zhì)研究已越來越受到重視。 優(yōu)質(zhì)食味品質(zhì)稻米具有較低直鏈淀粉含量(AC)、較高膠稠度(GC)以及較低糊化溫度(GT)[1-3]等優(yōu)點。 有報道認為，蠟質(zhì)基因(Waxy，Wx)通過編碼結(jié)合于淀粉粒上的淀粉合成酶(Granuale bound starch synthase，GBSS)控制直鏈淀粉合成，是影響稻米食味品質(zhì)最重要的基因[4]。 Tian 等[5]進一步研究發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)基因是影響稻米直鏈淀粉合成和膠稠度指標的主效基因，同時對稻米糊化溫度也有微效影響。

軟米是一種米質(zhì)介于糯米與黏米之間的優(yōu)質(zhì)米，直鏈淀粉含量較低[6]。 胡大明等[7]報道顯示，香型水稻‘青香軟粳’稻米直鏈淀粉含量為9.3%，屬于軟米類品種。 李凌等[8]研究發(fā)現(xiàn)，‘青香軟粳’水稻蠟質(zhì)基因在第4 外顯子上堿基G 突變?yōu)锳，由此可能降低了稻米直鏈淀粉的合成。 由上海市松江區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心選育的香型水稻‘1013’(‘松早香1 號’)具有與‘青香軟粳’水稻相同的軟米基因[9]。 軟米因具有獨特的烹飪和食用品質(zhì)，如味甜、軟糯，米飯冷后不變硬，適于煮飯與熬粥，受到很多消費者的青睞。

香米是指具有特殊香味的稻米。 香味基因位于水稻第8 號染色體上，其編碼甜菜堿醛脫氫酶2(BADH2)[10]。 消費者同樣喜愛香型稻米。 香稻育種一直是育種家們非常重視的育種方向。

‘嘉禾218’屬于長粒型水稻品種，粒型似‘泰國香米’，其稻米外觀晶瑩透明，商品性能好[11]。 2009年，‘嘉禾218’被上海市青浦區(qū)引進種植，表現(xiàn)出綜合抗性較好、產(chǎn)量高、熟期較早、適應(yīng)性廣等特點[12]。盡管‘嘉禾218’前幾年在浙江省和上海市試種中都具有較好的表現(xiàn)，但是‘嘉禾218’稻米既不香，也不屬于軟米類型，與目前市場需求的香軟類型水稻存在一定的差距。 本研究以‘松早香1 號’為香味基因和軟米基因的供體親本，以‘嘉禾218’為轉(zhuǎn)育親本進行雜交、回交及自交，結(jié)合分子標記輔助選育長粒型的香型軟米水稻新品系“上師大19 號”，并對選育的“上師大19 號”水稻進行試種，考察農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀，分析稻米品質(zhì)，以期為在上海地區(qū)推廣長粒型的香型軟米水稻提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

親本水稻材料‘嘉禾218’和‘松早香1 號’分別由上海長禾農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司高磊經(jīng)理和上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心沈嘉清研究員惠贈。 2004 年和2005 年，‘嘉禾218’水稻在浙江省嘉興市參加水稻品種區(qū)域試驗，全生育期155 d，平均株高92.3 cm，112.5 粒∕穗，結(jié)實率86.3 %，千粒重29.2 g，產(chǎn)量分別為8 034 kg∕hm2和7 558.5 kg∕hm2[13]。 2017 年‘松早香1 號’在青浦區(qū)試種產(chǎn)量為6 720 kg∕hm2，米質(zhì)綜合評價好[14]。

1.2 “上師大19 號”水稻的選育

2012 年3 月在海南，以‘嘉禾218’水稻為母本，以‘1013’(即‘松早香1 號’)水稻為父本進行雜交，4 月收獲F1種子。 同年5 月在上海種植F1種子，9 月以‘嘉禾218’為母本、F1植株為父本進行回交并收獲BC1F1種子。 2012 年12 月至2013 年10 月，分別在海南和上海，繼續(xù)以‘嘉禾218’為母本，再連續(xù)回交2 代得到BC3F1種子。 在每一代回交前，都要對回交植株進行農(nóng)藝性狀和穎殼性狀考察，選取農(nóng)藝性狀較好并且長粒型的單株，進行香味基因和軟米基因檢測，將同時具有兩個目標基因的植株作為繼續(xù)回交的父本。

2014 年4 月在海南收獲BC3F2種子，于5 月在上海進行大量種植，9 月觀察植株開花時期和農(nóng)藝性狀，選取開花時期和籽粒長度接近‘嘉禾218’、株型較好的植株，取葉片再進行兩個目標基因檢測。 10 月底收獲兩個目標基因都純合的BC3F3種子。 2014 年12 在海南繼續(xù)擴繁兩個目標基因都純合單株的種子，2015 年4 月從各項性狀都一致的小區(qū)中混收種子，同時取單株收獲種子。

1.3 香味基因和軟米基因分子標記檢測

采用CTAB 法提取水稻植株葉片DNA。 香味基因和軟米基因檢測方法分別參照許言福等[15]和謝米雪等[9]的報道。 PCR 擴增香味基因的上下游引物序列分別為：CAGCGGCAGCTCTTCGTCGC(C2-F)和CAGCCATGCTTCCAACTTATTCC(C2-R)；PCR 擴增軟米基因的上下游引物序列分別為：AGCGTTGTGGCTGAGGTAGG(Wx-F)和TGAAGTATGGGTTGTTGTTGAG(Wx-R)。

在兩種分子標記檢測中，酶切產(chǎn)物均使用2% 瓊脂糖凝膠進行電泳檢測分析，電壓120 V，時間40 min。

1.4 農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀分析

“上師大19 號”水稻于2016 年5 月在上海上實現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司進行試種。 試種面積13.34 m2，3 個重復(fù)，記錄農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀。

2017 年5 月在上海師范大學閔行基地試種“上師大19 號”水稻，株行距為15 cm ×20 cm。 水稻成熟時，在面積約為3 m2的小區(qū)中間隨機選取5 棵單株，記錄農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀，并進行統(tǒng)計分析。

1.5 稻米品質(zhì)指標分析

“上師大19 號”水稻稻谷品質(zhì)由農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督及檢驗測試中心進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 香味基因和軟米基因的檢測

2.1.1 香味基因的檢測

本課題組曾檢測‘松早香1 號’水稻甜菜堿醛脫氫酶2 基因，發(fā)現(xiàn)其含有第二外顯子突變類型的香味基因(badh2-E2)(未報道)。 根據(jù)badh2-E2 與非香基因Badh2 在+310 bp 位點脫氧核苷酸的差異性，采用CAPS(EheⅠ)分子標記對回交及自交后代進行香味基因檢測[15]。

對于回交植株，PCR 產(chǎn)物經(jīng)EheⅠ酶切后電泳，會出現(xiàn)同時具有292 bp 和375 bp 兩條帶，以及同時具有292 bp、375 bp 和667 bp 三條帶的兩種帶型(圖1)。 兩種帶型分別對應(yīng)無香味基因和香味基因呈雜合狀態(tài)。 在進行回交時，選取具有292 bp、375 bp 和667 bp 三條帶的單株作為父本。

對于BC3F2自交植株，PCR 產(chǎn)物經(jīng)EheⅠ酶切后電泳，會出現(xiàn)三種帶型：只有667 bp 一條帶、同時具有292 bp 和375 bp 兩條帶、同時具有292 bp、375 bp 和667 bp 三條帶(圖2)。 三種帶型分別對應(yīng)純合香味基因、無香味基因和香味基因呈雜合狀態(tài)。 在BC3F2自交植株檢測時，保留只有667 bp 一條帶，即香味基因呈純合狀態(tài)的植株。

2.1.2 軟米基因的檢測

根據(jù)謝米雪等[9]在Wx基因第4 外顯子+693 bp 處G∕A 堿基差異建立的CAPS(NlaⅢ)分子標記，對回交和自交植株進行軟米基因鑒定。Wx基因的PCR 產(chǎn)物經(jīng)NlaⅢ酶切后，同時具有380 bp 和177 bp 兩條帶屬于純合軟米基因型，如果只有一條557 bp 條帶說明是無軟米基因，同時具有557 bp、380 bp 和177 bp三條帶表明軟米基因為雜合狀態(tài)。

檢測回交植株，電泳顯示有兩種帶型：只有557 bp 一條帶和同時具有557 bp、380 bp、177 bp 三條帶(圖3)。 在回交操作中，選取同時具有557 bp、380 bp、177 bp 三條帶的植株作為回交父本。

對BC3F2自交植株檢測，電泳顯示有三種帶型：只有557 bp 一條帶、同時具有380 bp 和177 bp 兩條帶、同時具有557 bp、380 bp、177 bp 三條帶(圖4)。 在BC3F2自交植株檢測中，保留同時具有380 bp 和177 bp 兩條帶，即軟米基因呈純合的植株。

2.2 農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀考察

2016 年，“上師大19 號”水稻在上海上實現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司崇明東灘試種，5 月20 日播種，6 月17 日移栽，9 月4 日開花，10 月23 日成熟，全生育期156 d。 農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀考察顯示，每667 m2高峰苗數(shù)23.63 萬，有效穗數(shù)19.63 萬，成穗率83.1%，株高91.45 cm，穗長20.0 cm。 “上師大19 號”水稻每穗總粒數(shù)120.2 粒，每穗實粒數(shù)106.4 粒，結(jié)實率88.50%，稻谷千粒重30.30 g。 三個小區(qū)測產(chǎn)，“上師大19 號”水稻實際產(chǎn)量平均為8 234.4 kg∕hm2。 “上師大19 號”水稻對葉瘟、穗莖瘟和白葉枯病均具有較強的抗性，病情指數(shù)均為0，但略感紋枯病，病情指數(shù)為1.24。

2017 年5 月22 日在上海市閔行區(qū)播種“上師大19 號”，6 月18 日人工插秧。 “上師大19 號”水稻在9 月5 開花，10 月下旬成熟，總生育期約157 d。 水稻株高平均為97.4 cm，單株平均有效穗數(shù)9.2 個，平均每穗實粒數(shù)80.8 粒，結(jié)實率87.01%，千粒重29.07 g，單株重26.31 g。 根據(jù)株行距為15 cm ×20 cm 折算，推測“上師大19 號”水稻理論產(chǎn)量為8 774.4 kg∕hm2。

2.3 稻米品質(zhì)指標分析

經(jīng)農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督及檢驗測試中心檢測，“上師大19 號”水稻糙米率為83.2%，精米率為75.0%，整精米率為65.6%，粒長7.2 mm，長寬比3.1，堊白率20%，堊白度1.7%，透明度1 級，堿消值7.0 級，膠稠度72 mm，直鏈淀粉含量8.0%，蛋白質(zhì)含量8.3%。

3 討論

‘泰國香米’在國內(nèi)有較大影響力，歷來受到上海市民的歡迎。 由于受‘泰國香米’粒型的影響，長粒型稻米的市場競爭力也相對較高。 對于水稻兩大亞種，粳稻的蒸煮食味品質(zhì)一般好于秈稻，粒型大多為短圓型。 雖然秈稻食味品質(zhì)不如粳稻，但秈稻粒型大多為長粒型，外觀品質(zhì)大多好于粳稻。 在粳稻品種選育中，對長粒型遺傳種質(zhì)的選擇，已經(jīng)成為近年來一種趨勢[16]。

目前，長粒型粳稻代表品種有‘嘉禾218’。 本研究以‘嘉禾218’水稻作為回交親本選育出“上師大19 號”水稻，其農(nóng)藝性狀及全生育期與‘嘉禾218’水稻接近。 據(jù)浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學院等單位在2005年和2006 年試種‘嘉禾218’水稻發(fā)現(xiàn)，‘嘉禾218’平均葉瘟0.25 級，穗瘟2.75 級，穗瘟損失率4.05%、白葉枯病7.0 級[11]。 本研究選育的“上師大19 號”水稻對葉瘟、穗莖瘟和白葉枯病都具有較強的抗性，病情指數(shù)均為0，但略感紋枯病，病情指數(shù)為1.24。

黃海祥等[11]和韓娟英等[17]報道，‘嘉禾218’水稻高抗條紋葉枯病。 本課題組曾采用許言福等[18]和王英存等[19]方法分析‘嘉禾218’水稻基因組DNA，發(fā)現(xiàn)‘嘉禾218’水稻含有條紋葉枯病抗性基因qSTV11KAS(未報道)。 本研究選育的“上師大19 號”水稻也含有與‘嘉禾218’水稻相同的條紋葉枯病抗性基因qSTV11KAS。 Zhang 等[20]報道認為，含有qSTV11KAS基因的水稻對條紋葉枯病具有較強抗性。 盡管本研究沒有對“上師大19 號”水稻進行抗條紋葉枯病性狀考察，但從其含有與‘嘉禾218’水稻相同的條紋葉枯病抗性基因qSTV11KAS推測，“上師大19 號”水稻在生產(chǎn)中也將會表現(xiàn)出較好的抗條紋葉枯病特性。

前些年有文獻報道‘嘉禾218’水稻的稻谷品質(zhì)[11，17，21]。 與‘嘉禾218’水稻比較，本研究選育的“上師大19 號”水稻堊白率和堊白度比‘嘉禾218’水稻略高些，但整精米率高于‘嘉禾218’水稻，并且稻米直鏈淀粉含量僅為8.0%，已明顯低于‘嘉禾218’水稻，達到了軟米程度。 “上師大19 號”水稻稻谷其他品質(zhì)指標與‘嘉禾218’水稻接近。

依據(jù)國際水稻研究所的標準，長寬比大于3.0 者即為細長型。 我國優(yōu)質(zhì)秈米的新標準是長寬比大于2.8。 長寬比大于2.5，整精米粒長≥6.5 mm 即為長粒粳稻[16]。 “上師大19 號”水稻粒長為7.2 mm，長寬比為3.1，粒型與‘嘉禾218’水稻相似，但稻米直鏈淀粉含量僅為8.0%，因此，“上師大19 號”水稻屬于長粒型的香型軟米。

目前，上海市及周邊地區(qū)推廣種植的香型軟米水稻都屬于短粒型的，如上海市種植面積較大的‘青香軟粳’水稻。 胡大明等[7]在2010—2013 年考察了‘青香軟粳’水稻的外觀品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)‘青香軟粳’稻米堊白率和堊白度平均值分別為54.25%和12.23%。 從堊白率和堊白度檢測結(jié)果顯示，“上師大19 號”稻米外觀品質(zhì)明顯好于‘青香軟粳’水稻。 “上師大19 號”水稻的成功選育，為進一步開發(fā)外觀較好的香型軟米水稻奠定了基礎(chǔ)。