樊艷爽 唐亞麗

摘要：枯草芽孢桿菌具有代時短，抗逆性強，安全高效，無致病性的優(yōu)點，廣泛應用于各個領域。本文針對枯草芽孢桿菌的應用專利進行統(tǒng)計分析，包括專利申請量趨勢、申請人類型分析以及重點應用領域成果概況，旨在為我國微生物研究應用的發(fā)展提供參考。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌;發(fā)酵;專利技術;

中圖分類號：G306;TQ925.2文獻標識碼：A 文章編號：1003-5168（2020）12-0109-04

1 枯草芽孢桿菌的簡介

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一類革蘭氏陽性、好氧型、內生抗逆孢子的桿狀細菌，廣泛存在于土壤、湖泊、海洋和動植物的表面，為芽孢桿菌科（Bacillaceae）的模式菌株。自18世紀發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌以來，其發(fā)展歷經(jīng)100多年。國內外研究者們的早期大部分工作集中在枯草芽孢桿菌的形態(tài)觀察、分類鑒定、生理機制、功能發(fā)掘及防治等方面[1]，隨著對此菌性能進行的系統(tǒng)性的研究，該過程積累了豐富的研究資料。

由于該菌生長速度快、營養(yǎng)需求簡單、易于存活、無致病性、環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，并可以分泌多種酶和抗生素，而且還具有良好的發(fā)酵基礎，基于上述特點，使得枯草芽孢桿菌用途十分廣泛[2]，其應用主要集中于醫(yī)藥、食品、農業(yè)、環(huán)保等領域，并具體涉及到發(fā)酵產(chǎn)酶、食品發(fā)酵、農作物病蟲害防治與促生長、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、環(huán)境修復等方面。隨著對枯草芽孢桿菌的深入研究，枯草芽孢桿菌在現(xiàn)代科學研究中也體現(xiàn)出很高的應用價值，例如近年來，對枯草芽孢桿菌的研究漸進到遺傳學與分子生物學領域，研究內容具體體現(xiàn)在特定功能基因的尋找并克隆到需要的物種中或者通過誘變、基因工程等手段對枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌進行遺傳改造等。

2 枯草芽孢桿菌的專利申請分析

針對枯草芽孢桿菌的研究和應用進展，本文以枯草芽孢桿菌分別與酶、醫(yī)藥、飼料、生防、農藥、水處理、基因等作為主要關鍵詞在CNABS（中國專利文摘數(shù)據(jù)庫）和DWPI（德溫特世界專利數(shù)據(jù)庫）進行檢索;本文專利數(shù)據(jù)庫檢索時限截止于2019年12月。

圖1顯示了從2000年至2019年涉及的枯草芽孢桿菌在發(fā)酵產(chǎn)酶、醫(yī)藥、飼料等領域的專利申請量的發(fā)展趨勢。從圖1可以看出，從2000年至2017年枯草芽孢桿菌的發(fā)展整體處于穩(wěn)步增長的趨勢，其中2012年至2013年的增幅最大，2000年至2006年處于緩慢發(fā)展階段。由于枯草芽孢桿菌的安全、環(huán)境兼容性好和不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，滿足了現(xiàn)代社會對農業(yè)生產(chǎn)及有害生物綜合防治的要求，在現(xiàn)代生物技術領域得到廣泛應用;但是，發(fā)展總會伴隨著新的突破，從宏觀到微觀的研究，從常規(guī)的應用到基因組和蛋白質組學方面的研究還有待進一步深入，產(chǎn)業(yè)開發(fā)也有待進一步加強。

關于枯草芽孢桿菌的中國專利申請，其申請人類型的分布參見圖2。其中，企業(yè)的專利申請量遙遙領先，大專院校的申請量次之，個人名義申請的專利數(shù)量也不容小視，科研單位的申請量較少。可見，枯草芽孢桿菌的實際工業(yè)研究應用較多，科研單位的專利申請量不多。

枯草芽孢桿菌現(xiàn)已廣泛應用于各個領域，各個領域的申請量如圖3所示。其中，涉及利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的應用申請量較多;枯草芽孢桿菌作為基因工程受體菌，在遺傳學和分子生物學中的研究應用的申請量次之。隨著綠色生物技術的發(fā)展，人們對安全性和生物資源利用度的關注，采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備飼料、肥料的申請量也較高。而對于生防菌株和水處理的應用較其他領域較少。

3 枯草芽孢桿菌在不同領域的應用分析

經(jīng)檢索和初步閱讀后，對檢索到的專利申請按照應用的領域進行分類，主要分為4方面：發(fā)酵、農業(yè)、環(huán)境處理、分子生物學等。

3.1 枯草芽孢桿菌在發(fā)酵產(chǎn)酶中的應用

研究資料表明，枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等十幾種酶。成都地奧九泓制藥廠的發(fā)明專利CN 101316608B涉及一種枯草芽孢桿菌DIAO 1502（保藏編號為CCTCC NO：M204092）新菌株及其在制備血栓疾病藥物中的用途，將培養(yǎng)后的菌株作為發(fā)酵用種子液，并使用該種子液經(jīng)液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵得到納豆激酶，并將所述納豆激酶用于制備治療血栓疾病藥物。該發(fā)明的枯草芽孢桿菌新菌株，產(chǎn)酶率高，為工業(yè)化生產(chǎn)納豆激酶藥物制劑提供了新的途徑。山東科隆特酶制劑有限公司的發(fā)明專利CN105176883B涉及一種產(chǎn)中溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌，該菌株發(fā)酵酶活力高，可廣泛應用于啤酒、酒精、發(fā)酵工業(yè)的液化等行業(yè);青島蔚藍生物集團有限公司的發(fā)明專利CN103789227B涉及一株產(chǎn)堿性蛋白酶的枯草芽孢桿菌，在去污效果方面，該菌株所產(chǎn)的堿性蛋白酶優(yōu)于市場上的堿性蛋白酶。HANKYU BIOINDUSTRY 公司的發(fā)明專利JP2001069975A公開了一株產(chǎn)殼聚糖酶的枯草芽孢桿菌，獲得殼聚糖酶能夠有效的降低膽固醇、改善血糖水平和抑菌等;KOTTWITZ BEATRIX公司的發(fā)明專利EP1385943B1公開了一種衍生自枯草芽孢桿菌蛋白酶的新型堿性蛋白酶變體，該蛋白酶變體能夠用于洗滌劑和清潔劑;諾維信公司的發(fā)明專利EP1389228B1公開了一種洗滌劑組合物，該組合物包含表面活性劑和果膠酸裂解酶，所述果膠酸裂解酶由枯草芽孢桿菌菌株的內源DNA序列編碼。

3.2 枯草芽孢桿菌在農業(yè)生產(chǎn)中的應用

枯草芽孢桿菌在農業(yè)中的應用主要體現(xiàn)在其能夠應用于農作物病蟲害防治、農作物促生長劑、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的微生物添加劑（飼料添加劑）、養(yǎng)殖環(huán)境凈化劑、防治畜禽疾病等方面。中國農業(yè)科學院植物保護研究所的發(fā)明專利CN100404664C公開了一種作物青枯病生防枯草芽孢桿菌菌株，該菌株能夠抑制青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）的生長，生防實驗表明能夠防治煙草青枯病;煙臺綠云生物工程研究院有限公司的發(fā)明專利CN100352915C公開了一種新的枯草芽孢桿菌，使用該枯草芽孢桿菌通過發(fā)酵制備的微生態(tài)可以治療并預防條件致病菌引起的各種疾病，制劑既能夠與抗生素和化學制劑共同使用，降低抗生素和化學制劑的副作用，同時對耐藥性菌株引起的疾病有較好的治療效果，而且使用本制劑也可以防止致病菌的擴散，提高畜禽的自然免疫性;其同樣也是一種可以替代抗生素、無藥殘、無污染、療效高、安全型的微生態(tài)制劑;AMBROSOV VALERIJ ANTONOVICH公司的RU 2094990 C1發(fā)明專利涉及一株枯草芽孢桿菌菌株VKPM B-6554，該菌株能夠作為抗真菌制劑，如抵抗白僵菌、黃萎病菌、核盤菌等;漢森公司的發(fā)明專利WO 2018167171A1的枯草芽孢桿菌，該菌株可以作為飼料添加劑飼喂動物，能夠增加動物體重、降低壞死性腸炎病變等。

3.3 枯草芽孢桿菌在水處理中的應用

枯草芽孢桿菌吸附多種有害物或能夠分泌多種生物絮凝劑，因此，其在水處理和污染水治理方面也有十分廣泛的應用。建設部水處理新技術產(chǎn)業(yè)化基地的發(fā)明專利CN102533590B公開了一種低溫下去除污水中磷的枯草芽孢桿菌CGMCC No.5280，該菌株在低溫下，特別是在8-12℃的條件下，對磷去除有明顯的強化作用，磷去除率提高了10%，優(yōu)于一級A的出水標準（水溫≤12℃時，一級A標準的控制指標為0.5mg/L）。山西大學的發(fā)明專利CN102628066B公開了一種微生物絮凝劑的制備方法。該發(fā)明將枯草芽孢桿菌進行有氧擴大培養(yǎng)，將發(fā)酵液過濾，上清液減壓蒸發(fā)濃縮，得到發(fā)酵濃縮液，提取并干燥，得到微生物絮凝劑;或將濾餅用海藻酸鈉和聚乙烯醇固定化，制得固定化的微生物絮凝劑。該微生物絮凝劑能夠用于水處理工藝中的水質軟化，其對地下巖溶水的礦化度絮凝率達到36.92%左右，硬度絮凝率最大可達80.44%左右;KR20170050298 A涉及一種含有枯草芽孢桿菌的凈化水質組合物，該組合物能夠改善水質以達到長期凈化功能;RU2617951C1涉及一株枯草芽孢桿菌SNBS-1，該菌株能夠用于凈化石油和石油產(chǎn)品污染的土壤和水。

3.4 枯草芽孢桿菌在遺傳學與分子生物學中的應用

枯草芽孢桿菌作為基因工程受體菌，在遺傳學和分子生物學中也有廣泛的應用。江南大學的發(fā)明專利CN102925475B公開了利用一種新的轉運信號來實現(xiàn)外源蛋白質的分泌表達的方法，具體是利用枯草芽孢桿菌分子伴侶GroEL、烯醇酶Eno、鞭毛蛋白質Hag的前50個氨基酸編碼序列作為轉運信號，分別與外源目的蛋白質（BgaB）的編碼基因進行融合，構建能夠融合表達重組蛋白的質粒，并轉化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌株，從而實現(xiàn)融合蛋白質的分泌表達;華南理工大學的發(fā)明專利CN107857802A涉及一種β-半乳糖苷酶高效分泌表達的信號肽，該信號肽能夠實現(xiàn)外源基因的高表達，特別是為枯草芽孢桿菌表達外源基因提供了有效的元件;中國農業(yè)大學的發(fā)明專利CN107760655A涉及從枯草芽孢桿菌中分泌獲得黃曲霉毒素降解酶BADE，然后進行體外克隆和原核表達，獲得能夠降解黃曲霉毒素的降解酶;天津大學的發(fā)明專利CN103627663B涉及采用進化工程與全基因組測序結合的方法，發(fā)現(xiàn)了三個有利于枯草芽孢桿菌利用木糖生長的基因突變，通過基因工程技術將點突變引入野生菌株，獲得了能夠利用木糖快速生長的重組枯草芽孢桿菌;花王株式會社的JP 4955358B2的發(fā)明專利公開了通過使枯草芽孢桿菌基因組的大區(qū)域缺失而獲得的突變株，然后利用該突變株進行靶蛋白的表達。

4 結論與建議

通過對枯草芽孢桿菌的應用現(xiàn)狀及其專利申請的分析，筆者對于當前基因治療領域的發(fā)展態(tài)勢有了宏觀認識，并對主要應用領域進行了技術上的分析梳理。工業(yè)酶的生產(chǎn)依然是枯草芽孢桿菌應用的持續(xù)關注熱點，其次以基因工程應用及農業(yè)生產(chǎn)方面的應用偏多，醫(yī)藥方面應用的專利研究相對薄弱。

枯草芽孢桿菌由于其自身含有豐富的產(chǎn)酶系統(tǒng)，具備生產(chǎn)多種酶的應用潛力，是當今工業(yè)酶生產(chǎn)應用最廣泛的菌種之一，據(jù)不完全統(tǒng)計，枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的酶占整個酶市場的50%，這與該領域的專利申請人以企業(yè)為主，偏向工業(yè)應用的研究趨勢也是一致的。

我國酶制劑工業(yè)近年來取得了長足的發(fā)展，但其產(chǎn)業(yè)化應用暫不成熟，與世界同行業(yè)發(fā)展仍有差距。如醫(yī)藥方面，對具有治療效果的酶制劑進行商品化開發(fā)并不多見，有待于進一步研究。在農業(yè)方面，一些相應的生物菌劑并未得到大范圍推廣應用，應縮短理論轉化為應用的周期。另外，在科學研究方面，枯草芽孢桿菌也是研究的熱點材料。開發(fā)利用基因工程菌以滿足不同的應用需求，克服野生菌的不足也是未來的重點方向。

總之，中國科研院校和企業(yè)應該不斷克服技術障礙，在有價值專利方面投入更多的技術研究，做好專利布局，在未來的微生物菌種的開發(fā)和應用中占據(jù)有利位置。創(chuàng)新與應用并重，對市場前景好的相關技術進行開發(fā)應用，加快科技轉化，提升市場競爭力，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

參考文獻

[1] 惠明，竇麗娜，田青，候銀臣.枯草芽孢桿菌的應用研究進展[J].安徽農業(yè)科學，2008（27）：1623-6624，11627.

[2] 王曉閣.枯草芽孢桿菌研究進展與展望[J].中山大學研究生學刊（自然科學、醫(yī)學版），2012（3）：14-23.