舒慧珍,唐志凌,韓 薇,陳海明,陳衛(wèi)軍,胡月英,陳文學(xué),

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南 海口 570228；2.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院,海南 ?？?570228）

近年來(lái),食品安全面臨的主要問(wèn)題包括由腐敗菌和致病菌引起的食源性疾病,它們對(duì)公眾健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。隨著消費(fèi)模式的改變,冷鮮肉成為肉類消費(fèi)的主流,冷鮮肉的質(zhì)量安全也成為不容忽視的問(wèn)題。微生物對(duì)肉類的污染不僅對(duì)生產(chǎn)者和消費(fèi)者造成經(jīng)濟(jì)損失,而且對(duì)人體健康構(gòu)成嚴(yán)重的影響。冷鮮肉中常發(fā)現(xiàn)的腐敗性嗜冷菌有假單胞菌屬、莫拉氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬、氣單胞菌屬、腸肝菌屬、乳桿菌屬、熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）等[2]。腐敗變質(zhì)的食品對(duì)人體有很大危害,微生物代謝的產(chǎn)物不僅能導(dǎo)致人的過(guò)敏、中毒,還可通過(guò)消化道或呼吸道進(jìn)入人體,誘發(fā)某些病變[3]。

熱殺索絲菌是一種革蘭氏陽(yáng)性好氧和兼性厭氧型長(zhǎng)桿菌,生長(zhǎng)的溫度一般在0～30 ℃,可在冷凍肉類和海產(chǎn)品中產(chǎn)生異味并導(dǎo)致變質(zhì)。Jiang Yun等[4]的研究表明熱殺索絲菌是導(dǎo)致真空包裝冷卻豬肉4 ℃貯藏末期中腐敗的優(yōu)勢(shì)菌之一。Reid等[5]研究發(fā)現(xiàn)熱殺索絲菌是真空包裝牛肉中主要的嗜冷菌之一。Silbande等[6]研究認(rèn)為熱殺索絲菌是金槍魚冰貯過(guò)程中的主要腐敗菌,因其兼性厭氧和嗜冷的特點(diǎn),即便在真空低溫的條件下,也能利用食品中的營(yíng)養(yǎng)成分產(chǎn)生腐敗物質(zhì),導(dǎo)致肉品腐敗和變質(zhì)[7]。幾十年來(lái),人們制定各種策略來(lái)防止食品中致病菌和腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng),以達(dá)到保藏食品的目的,在食品工業(yè)中最常用、簡(jiǎn)便和高效的方法是向食品中加入化學(xué)防腐劑。但化學(xué)防腐劑的潛在毒性、微生物耐藥性、安全、殘留等問(wèn)題日益突出。天然防腐劑由于其抗菌性強(qiáng)、水溶性好、安全無(wú)毒、抑菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)使得人們?cè)桨l(fā)關(guān)注其開(kāi)發(fā)與研究[8]。

植物精油是一種有效的天然防腐劑,通常從香料和草藥中提取,具有良好的感官和防腐性能,可以抑制微生物生長(zhǎng),延長(zhǎng)貨架期[9]。單萜化合物是植物精油的主要成分,具有抗菌等多種生物活性。百里酚、薄荷醇、亞麻酸乙酯是3 種單萜化合物,通過(guò)破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲漏,對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有有效的抗菌活性[10]。β-石竹烯,又稱β-丁香油精,一種雙環(huán)倍半萜型的天然產(chǎn)物,其性狀為無(wú)色至微黃油狀液體,具有淡的丁香似香味[11]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)規(guī)定石竹烯可用作食用香料（GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》）。石竹烯廣泛存在于一些天然植物中,如作為海南黑、白胡椒的主要香氣成分,石竹烯的相對(duì)含量分別為44.41%和12.98%[12]。牡荊揮發(fā)油的主要成分為石竹烯（43.12%）,對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌、四聯(lián)球菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果[13]。但是,目前還鮮有石竹烯對(duì)B.thermosphacta的抑菌性能和抑制機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定最小抑菌濃度（minimum inhibition concentration,MIC）和生長(zhǎng)曲線等指標(biāo)確定石竹烯對(duì)B.thermosphacta的抑菌活性,并通過(guò)掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy,SEM）觀察、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）活力測(cè)定、二乙酸熒光素（fluorescein diacetate,FDA）染色實(shí)驗(yàn)、胞外鉀離子濃度、細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)含量、丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）、蘋果酸脫氫酶（malic dehydrogenase,MDH）活力和基因組DNA相對(duì)含量的測(cè)定等進(jìn)一步探究石竹烯對(duì)B.thermosphacta的抑菌機(jī)理,為石竹烯作為天然抑菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

B.thermosphacta廣東微生物菌種保藏中心；β-石竹烯（純度＞90%） 日本TCL公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯、瓊脂、無(wú)水乙醇、無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）、FDA、G250考馬斯亮藍(lán) 北京索萊寶科技有限公司；AKP活性測(cè)定試劑盒、MDH活性測(cè)定試劑盒、PK活性測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GI54DS型高壓滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；SW-CJ-1FD型無(wú)菌超凈工作臺(tái) 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；SPX-288型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；SHA-2型恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；CR22N型落地式高速冷凍離心機(jī)、S-3000型掃描電子顯微鏡日本日立公司；TU1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、TAS-990 Super AFG型原子吸收分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Alpha1型冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司；JYD-650L型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海五相儀器儀表有限公司；WGY-10型熒光分光光度計(jì) 天津港東科技發(fā)展股份有限公司；NanoPhotometer-N50型超微量分光光度計(jì) 德國(guó)Implen公司；SP-Max3500FL型多功能酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將B.thermosphacta接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h進(jìn)行傳代以恢復(fù)活性?；罨蟮腂.thermosphacta接種到滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,26 ℃培養(yǎng)18～24 h,使用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ蒙睇}水將菌液濃度稀釋至106～107CFU/mL備用。

1.3.2 MIC的測(cè)定

采用瓊脂稀釋法[14]測(cè)定MIC。將溶于20%（體積分?jǐn)?shù),下同）乙醇溶液的石竹烯2 倍梯度稀釋,得到不同質(zhì)量濃度石竹烯溶液,并與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均勻混合,使瓊脂培養(yǎng)基中石竹烯終質(zhì)量濃度分別為18.04、9.02、4.51、2.26、1.13、0.56 mg/mL,以加入等量無(wú)菌水和20%乙醇溶液的培養(yǎng)基分別為空白、陰性對(duì)照組。將200 μL稀釋至106～107CFU/mL的菌懸液均勻地涂布于平板上,26 ℃倒置培養(yǎng)24 h。觀察各平板菌落生長(zhǎng)情況,以肉眼看不見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小稀釋濃度為MIC。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定B.thermosphacta的生長(zhǎng)曲線[15]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B.thermosphacta濃度梯度稀釋為106～107CFU/mL,并按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,以加入1 倍和2 倍最小抑菌濃度（1×MIC、2×MIC）的石竹烯的組為實(shí)驗(yàn)組,以加入等量無(wú)菌水和20%乙醇溶液的培養(yǎng)基分別為空白、陰性對(duì)照組,在搖床中培養(yǎng),每隔1 h用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)定樣品OD值。

1.3.4 細(xì)胞形態(tài)的觀察

根據(jù)Diao Wenrui等[16]的方法,采用掃描電子顯微鏡觀察B.thermosphacta細(xì)胞外部形態(tài)的變化。向培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液中加入1×MIC、2×MIC石竹烯的組為實(shí)驗(yàn)組,加入等量無(wú)菌水和20%乙醇溶液的組分別為空白、陰性對(duì)照組,分別取培養(yǎng)4、8 h的菌懸液,低溫離心收集菌體。用PBS（pH 7.2）洗滌3 次,再用乙醇逐級(jí)脫水,將脫水后的菌體置于-20 ℃預(yù)冷凍2 h,冷凍干燥12 h后取樣鍍金,在掃描電子顯微鏡上觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5 AKP活力的測(cè)定

通過(guò)測(cè)定AKP活力來(lái)評(píng)價(jià)石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞壁的破壞程度。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的配制如1.3.4節(jié),將培養(yǎng)至0、3、6、9、12 h的菌液離心后取上清液,按照AKP試劑盒說(shuō)明書測(cè)定上清液AKP活力。

1.3.6 FDA染色實(shí)驗(yàn)

通過(guò)FDA熒光強(qiáng)度的測(cè)定來(lái)反映細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性和通透性。根據(jù)曾哲靈等[17]的方法做適當(dāng)調(diào)整。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B.thermosphacta6 000 r/min低溫離心收集菌體并重懸于無(wú)菌生理鹽水中,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的配制如1.3.4節(jié)。在培養(yǎng)至6、9、12 h分別取樣離心收集菌體,用PBS洗滌2 次后與250 μL FDA-丙酮溶液（2 mg/mL）在常溫下共同孵育20 min,加入PBS洗滌,低溫離心,棄去上清液,重復(fù)3 次后,再將菌體重懸于PBS中,用熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣品的平均熒光強(qiáng)度。

1.3.7 細(xì)胞外鉀離子質(zhì)量濃度的測(cè)定

測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞中鉀離子的外流是研究抗菌藥物對(duì)細(xì)胞膜損傷的經(jīng)典方法。通過(guò)鉀離子釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞壁和膜的影響。參考Miao Jianyin等[18]的方法并做適當(dāng)調(diào)整。低溫離心培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌體,用生理鹽水（0.9%光譜純NaCl、超純水稀釋）將收集到的菌體洗滌3 次并重懸于等量生理鹽水中,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的配制如1.3.4節(jié),在0、0.5、1、2、3、4 h分別取樣,10 000 r/min離心取上清液,并用超純水稀釋至適當(dāng)濃度,使用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。

1.3.8 細(xì)胞外蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

通過(guò)測(cè)定細(xì)胞外蛋白質(zhì)量濃度來(lái)判斷石竹烯對(duì)B.thermosphacta蛋白質(zhì)泄漏情況的影響。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的配制如1.3.4節(jié)。分別取培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12 h的菌懸液低溫離心,取上清液,采用考馬斯亮藍(lán)法,用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.9 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度來(lái)研究石竹烯對(duì)B.thermosphacta蛋白質(zhì)合成的影響以及為后續(xù)MDH活力的測(cè)定提供計(jì)算基礎(chǔ)。參考He Mengying等[19]的方法。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的配制如1.3.4節(jié),用PBS將低溫離心收集到的培養(yǎng)至0、3、6、9、12、24 h的菌體洗滌3 次并重懸。上機(jī)破碎細(xì)胞5 min,10 000 r/min離心10 min,取上清液冷藏于4 ℃。采用考馬斯亮藍(lán)法,用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.10 MDH活力的測(cè)定

通過(guò)MDH活力的變化來(lái)研究石竹烯對(duì)B.thermosphacta糖代謝和三羧酸循環(huán)等的影響。采用MDH試劑盒測(cè)定的方法,將工作液37 ℃預(yù)溫,取100 μL 1.3.9節(jié)中超聲破碎后的樣液,再加入1 mL工作液,混合均勻后,開(kāi)始計(jì)時(shí),在20、80 s時(shí)記錄吸光度分別為A1、A2。計(jì)算2 次吸光度差（ΔA＝A1-A2）,按公式（1）計(jì)算MDH活力。

式中：微摩爾消光系數(shù)為6.2 L/（μmol·cm）；測(cè)定ΔA為20 s時(shí)測(cè)定管的吸光度與80 s時(shí)的測(cè)定管吸光度的差值；空白ΔA為20 s時(shí)空白管的吸光度與80 s時(shí)的空白管吸光度的差值；比色皿半徑為0.5 cm；反應(yīng)液總體積為1.1 mL；取樣量為0.1 mL；待測(cè)樣本蛋白質(zhì)量濃度單位為mg/mL。

1.3.11 PK活力的測(cè)定

通過(guò)PK活力的變化研究石竹烯對(duì)B.thermosphacta糖酵解等代謝途徑的影響。采用PK試劑盒測(cè)定的方法。將在37 ℃預(yù)溫的試劑與100 μL 1.3.9節(jié)中超聲破碎后的樣液混合均勻,計(jì)時(shí)、進(jìn)行比色,在0.5、15.5 min時(shí)記錄吸光度分別為A1、A2,第一次記錄后要將反應(yīng)液倒入原試管中,將試管水浴15 min,再上機(jī)記錄第二次,計(jì)算2 次吸光度差（ΔA＝A1－A2）,按公式（2）計(jì)算PK活力。

式中：ΔA為30 s時(shí)測(cè)定管的吸光度與15 min 30 s時(shí)測(cè)定管吸光度的差值；毫摩爾消光系數(shù)為6.22 L/（mmol·cm）；反應(yīng)時(shí)間為15 min；比色皿半徑為0.5 cm；反應(yīng)液總體積為1.195 mL；取樣量為0.02 mL。

1.3.12 細(xì)菌基因組DNA相對(duì)含量的測(cè)定

用熒光光譜法研究石竹烯與B.thermosphactaDNA的相互作用。按照試劑盒說(shuō)明書的方法提取B.thermosphacta細(xì)菌基因DNA。提取的DNA的純度和濃度用超微量分光光度計(jì)分別通過(guò)260 nm和280 nm波長(zhǎng)處的光密度值比（OD260nm/OD280nm＝1.8）和OD260nm確定[20]。用0.01 mol/L Tris-HCl（pH 7.2）緩沖液將細(xì)菌基因組DNA稀釋至60 μg/mL。將不同質(zhì)量濃度的石竹烯溶液（0、1×MIC、2×MIC、4×MIC）加入到相同體積的DNA溶液中,并在37 ℃在黑暗中溫育10 min。采用多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm處,測(cè)量混合物從300 nm到500 nm的熒光光譜,狹縫寬度為10 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析,P＜0.05表示存在顯著性差異,使用Origin 2018軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 石竹烯對(duì)B.thermosphacta的MIC

表1 B.thermosphacta生長(zhǎng)情況Table 1 Growth of B.thermosphacta

由表1可知,石竹烯對(duì)B.thermosphacta有較好的抑菌效果,且抑菌能力隨著其質(zhì)量濃度的增加而增加,當(dāng)石竹烯質(zhì)量濃度為4.51 mg/mL時(shí)細(xì)菌不能生長(zhǎng),即石竹烯對(duì)B.thermosphacta的MIC為4.51 mg/mL,且20%乙醇溶液對(duì)B.thermosphacta的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。

2.2 石竹烯對(duì)B.thermosphacta生長(zhǎng)的影響

在一定的波長(zhǎng)范圍內(nèi),菌懸液濃度與吸光度成正比[21],可通過(guò)OD值變化來(lái)評(píng)判石竹烯對(duì)B.thermosphacta的抑制和殺滅作用。如圖1所示,空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組呈現(xiàn)典型細(xì)菌生長(zhǎng)特點(diǎn)的S型生長(zhǎng)曲線。在10～18 h期間,兩組的細(xì)菌迅速生長(zhǎng),乙醇組相較于空白組略緩慢,但最終幾乎同時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期,這表示20%乙醇溶液對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)影響甚微。在加入終質(zhì)量濃度為1×MIC和2×MIC石竹烯的菌液中,菌液OD600nm顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）,細(xì)菌幾乎停止生長(zhǎng)。結(jié)果表明在接種體積分?jǐn)?shù)5%的106～107CFU/mLB.thermosphacta后加入終質(zhì)量濃度為1×MIC和2×MIC的石竹烯能夠有效抑制B.thermosphacta的生長(zhǎng)。

圖1 石竹烯對(duì)B.thermosphacta生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of caryophyllene on the growth of B.thermosphacta

2.3 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2 B.thermosphacta掃描電子顯微鏡圖（8 000×）Fig.2 Scanning electron microphotographs of B.thermosphacta (8 000 ×)

如圖2所示,空白組（圖2A1、A2）中的菌體呈正常短桿狀,圓潤(rùn)飽滿、表面光滑、邊緣整齊、形狀規(guī)則、粗細(xì)均勻一致,未出現(xiàn)細(xì)胞破裂、內(nèi)容物溢出等現(xiàn)象。陰性對(duì)照組（圖2B1、B2）中B.thermosphacta經(jīng)乙醇處理4、8 h后細(xì)胞表面有輕微的褶皺,受到的破壞很小,大部分菌體完好,可見(jiàn)20%乙醇溶液對(duì)B.thermosphacta的影響甚微。經(jīng)石竹烯作用4 h的B.thermosphacta（圖2C1、D1）,能觀察到菌體表面粗糙,出現(xiàn)褶皺,在細(xì)胞周圍觀察到許多細(xì)胞碎片,部分菌體分裂,從而引起細(xì)胞內(nèi)容物的外泄。經(jīng)石竹烯處理8 h的B.thermosphacta（圖2C2、D2）形態(tài)受到破壞,菌體萎陷,邊緣模糊,細(xì)胞表面粗糙不平并出現(xiàn)孔洞,細(xì)胞內(nèi)容物外泄。由此可見(jiàn),石竹烯能破壞B.thermosphacta的完整性,使細(xì)胞內(nèi)容物泄漏。

2.4 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞壁通透性的影響

在細(xì)胞正常情況下,不能在胞外檢測(cè)到AKP活力,當(dāng)細(xì)胞壁受到一定破壞時(shí),其通透性增加,存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間的AKP容易泄漏到細(xì)胞外,因此通過(guò)檢測(cè)胞外AKP活力的變化,可反映細(xì)菌細(xì)胞壁受損壞的情況[22]。由圖3可知,在1×MIC、2×MIC石竹烯作用的菌液中AKP活力極顯著大于對(duì)照組中AKP活力（P＜0.01）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),檢測(cè)到空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞外AKP含量變化很小,而實(shí)驗(yàn)組在經(jīng)石竹烯處理2 h后開(kāi)始出現(xiàn)AKP的大量滲出,而且添加2×MIC石竹烯的菌液中檢測(cè)到的AKP泄漏量明顯高于1×MIC。0～8 h內(nèi),1×MIC石竹烯作用的菌液中AKP活力穩(wěn)定上升,2×MIC石竹烯作用的菌液中AKP活力波動(dòng)較大,但仍呈上升的趨勢(shì)。結(jié)果表明石竹烯能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞壁損傷而作用于細(xì)胞壁,增加細(xì)胞壁的通透性,導(dǎo)致大量AKP外泄到胞外。

圖3 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞外AKP活力的影響Fig.3 Effect of caryophyllene on the activity of extracellular AKP in B.thermosphacta

2.5 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞膜通透性的影響

圖4 石竹烯對(duì)B.thermosphacta 細(xì)胞膜通透性的影響Fig.4 Effect of caryophyllene on cell membrane permeability of B.thermosphacta

研究表明大多數(shù)抑菌物質(zhì)都作用于細(xì)胞膜,細(xì)胞膜能夠維持細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和能量的平衡,使細(xì)胞維持正常的生命活動(dòng)[23]。FDA進(jìn)入細(xì)胞后可被酶水解為在細(xì)胞中發(fā)出黃綠色熒光的熒光素,若細(xì)胞膜受到破壞,熒光素分子會(huì)流到細(xì)胞外,導(dǎo)致FDA熒光強(qiáng)度降低[24]。FDA熒光強(qiáng)度低表明細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞膜完整性被破壞,熒光從胞漿中外漏。由圖4可知,由于細(xì)菌增長(zhǎng)繁殖,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)滯留的熒光素分子含量增加,空白組和陰性對(duì)照組的熒光強(qiáng)度顯著增加,顯著高于1×MIC組和2×MIC組（P＜0.05）。經(jīng)1×MIC石竹烯處理的菌液熒光強(qiáng)度在6～12 h內(nèi)增長(zhǎng)緩慢,經(jīng)2×MIC石竹烯作用的菌液熒光強(qiáng)度在6～9 h期間緩慢增長(zhǎng),直至12 h略有下降。說(shuō)明石竹烯能破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性、導(dǎo)致FDA外泄,并隨著石竹烯質(zhì)量濃度從1×MIC增加至2×MIC,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),破壞程度更為明顯。

2.6 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞外鉀離子質(zhì)量濃度的影響

當(dāng)微生物細(xì)胞膜被破壞,其通透性變化,則會(huì)導(dǎo)致一些電解質(zhì)泄漏,如鉀離子[25]。由圖5可知,空白組和陰性對(duì)照組中,胞外鉀離子的質(zhì)量濃度幾乎沒(méi)有增長(zhǎng),且在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)極顯著低于用石竹烯處理的菌液中的鉀離子質(zhì)量濃度（P＜0.01）。1×MIC、2×MIC石竹烯作用的菌液中,胞外鉀離子濃度顯著增大（P＜0.05）,在0～0.5 h,鉀離子質(zhì)量濃度迅速增加。細(xì)胞外鉀離子的存在表明鉀離子從細(xì)菌細(xì)胞中泄漏,且在處理0.5 h內(nèi)鉀離子出現(xiàn)大量泄漏,這是由于石竹烯破壞B.thermosphacta的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),細(xì)胞膜通透性增加,從而導(dǎo)致鉀離子等細(xì)胞原生質(zhì)內(nèi)容物的泄漏。經(jīng)石竹烯處理后細(xì)胞內(nèi)鉀離子流出量的增加為石竹烯對(duì)細(xì)菌膜損傷機(jī)制提供了更多的依據(jù)。

圖5 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞外鉀離子質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of caryophyllene on extracellular potassium ion concentration in B.thermosphacta

2.7 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞外蛋白質(zhì)量濃度的影響

圖6 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞外蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig.6 Effect of caryophyllene on extracellular protein concentration in B.thermosphacta

由圖6可知,空白組和陰性對(duì)照組中胞外蛋白質(zhì)量濃度雖有一定程度的波動(dòng)但最終趨于平穩(wěn),且低于用石竹烯處理后的B.thermosphacta懸液中的胞外蛋白質(zhì)量濃度,說(shuō)明石竹烯損傷細(xì)胞,破壞細(xì)胞的完整性,導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)大量外泄。1×MIC石竹烯溶液作用的菌液中胞外蛋白質(zhì)量濃度顯著增加（P＜0.05）,在0～4 h內(nèi),迅速增加,4 h后有輕微波動(dòng)。2×MIC石竹烯溶液作用的菌液中胞外蛋白質(zhì)量濃度低于1×MIC石竹烯溶液作用后的菌液且滲出速率緩慢,可能是因?yàn)榫w受到高質(zhì)量濃度石竹烯的作用,其自我修復(fù)功能受到激發(fā)[26],少數(shù)菌體恢復(fù)活力,繼續(xù)生存繁殖,菌液中的蛋白質(zhì)被正在生長(zhǎng)的菌體所消耗,蛋白質(zhì)滲出胞外的速率也相對(duì)小于1×MIC石竹烯作用的菌液中的滲出速率。

2.8 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度的影響

圖7 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig.7 Effect of caryophyllene on intracellular protein concentration in B.thermosphacta

由圖7可知,空白組和陰性對(duì)照組中,隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),B.thermosphacta大量繁殖,代謝旺盛,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度呈增加的趨勢(shì),經(jīng)石竹烯作用的菌液中蛋白質(zhì)量濃度小于對(duì)照組。1×MIC石竹烯作用的菌液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度波動(dòng)較大,但總體呈下降趨勢(shì),2×MIC石竹烯作用的菌液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度呈下降趨勢(shì),波動(dòng)小于1×MIC組。由此可知,石竹烯的質(zhì)量濃度越大,越能使胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度穩(wěn)定下降。結(jié)合2.7節(jié)結(jié)果可知,胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度下降可能是因?yàn)榧?xì)胞膜通透性增加,胞內(nèi)蛋白外泄。也可以推測(cè)石竹烯能夠引起細(xì)菌蛋白合成途徑受阻,破壞蛋白質(zhì)合成,導(dǎo)致代謝功能障礙,甚至細(xì)胞死亡。

2.9 石竹烯對(duì)B.thermosphacta MDH活力的影響

MDH是生物體進(jìn)行糖代謝的關(guān)鍵酶之一[27]。在線粒體中MDH可調(diào)節(jié)作為生物細(xì)胞中重要氧分解代謝途徑的三羧酸循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)速率,作為NADP陽(yáng)離子自由基的輔酶,在生物合成過(guò)程中從代謝產(chǎn)物中接受H+形成NADPH,因此MDH活性能反映細(xì)胞代謝是否正常[28]。由圖8可知,空白組和陰性對(duì)照組MDH活力在一定時(shí)間的波動(dòng)后極顯著高于1×MIC、2×MIC石竹烯作用的菌液中的MDH活力（P＜0.01）。1×MIC組中MDH活力在12 h前總體呈上升趨勢(shì),12 h后顯著下降,2×MIC組在處理3 h后MDH活力出現(xiàn)顯著下降后在6 h時(shí)呈上升趨勢(shì),6 h后MDH活力急速下降并始終低于1×MIC組中MDH活力,這種變化與Hu Yichen等[29]的研究結(jié)果一致。表明石竹烯對(duì)MDH活力有一定抑制作用,并且石竹烯的質(zhì)量濃度越大,對(duì)MDH活力抑制程度越高,抑制作用也越早顯現(xiàn)出來(lái)。MDH活力下降可能是因?yàn)槭裣┡cMDH相結(jié)合,導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,使其活性降低[23]。

圖8 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞中MDH活力的影響Fig.8 Effect of caryophyllene on MDH activity in B.thermosphacta

2.10 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞中PK活力的影響

在糖酵解途徑中,PK是關(guān)鍵限速酶之一[30],能促進(jìn)糖酵解產(chǎn)生丙酮酸,對(duì)能量代謝有一定促進(jìn)作用。丙酮酸在細(xì)胞代謝過(guò)程中,聯(lián)系著糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)[31]。

圖9 石竹烯對(duì)B.thermosphacta細(xì)胞中PK活力的影響Fig.9 Effect of caryophyllene on PK activity in B.thermosphacta

由圖9可知,空白組和陰性對(duì)照組的PK活力顯著增加（P＜0.05）,隨著時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)菌大量繁殖,糖酵解反應(yīng)活躍,PK活力增強(qiáng)。經(jīng)1×MIC、2×MIC石竹烯作用的菌液中PK活力雖有輕微波動(dòng),但在處理6～24 h內(nèi)PK活力顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）,表明PK活力受到抑制,則丙酮酸的產(chǎn)生也受到抑制,丙酮酸是生產(chǎn)乙酰輔酶A的原料,乙酰輔酶A是三羧酸循環(huán)中的初始反應(yīng)物[32],結(jié)合2.9節(jié)結(jié)果,MDH活性也受到了抑制,而MDH是三羧酸循環(huán)中重要的酶,說(shuō)明三羧酸循環(huán)受到抑制,即影響細(xì)胞正常代謝。經(jīng)過(guò)石竹烯處理后酶活力的降低可能是由于其與酶?jìng)?cè)鏈發(fā)生反應(yīng)并引起結(jié)構(gòu)變化,進(jìn)而導(dǎo)致酶構(gòu)象的改變。此外,細(xì)菌的呼吸鏈位于細(xì)胞膜上,細(xì)胞膜參與了細(xì)菌各種重要的生命活動(dòng),如細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換、高分子結(jié)構(gòu)的合成和酶分泌等[33]。因此,石竹烯的處理會(huì)干擾細(xì)菌的呼吸和能量代謝,破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和呼吸鏈上酶系統(tǒng)的功能,從而干擾細(xì)菌的正常生命活動(dòng)。

2.11 石竹烯對(duì)細(xì)菌基因組DNA的影響

DNA的破壞會(huì)阻礙基因的表達(dá),從而阻礙正常酶和受體的合成,甚至導(dǎo)致細(xì)菌死亡[34]。因此,采用DNA研究中最敏感的技術(shù)之一——熒光光譜技術(shù)研究石竹烯與DNA的相互作用[35]。

圖10 B.thermosphacta基因組DNA在不同質(zhì)量濃度石竹烯作用下的熒光光譜Fig.10 Fluorescence spectra of genomic DNA of B.thermosphacta in the presence of different concentrations of caryophyllene

如圖10所示,將不同質(zhì)量濃度的石竹烯加入到含有DNA的溶液中后,熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)且隨著石竹烯質(zhì)量濃度增加而增加。這可能是由于相鄰堿基對(duì)之間的平面石竹烯堆疊引起的DNA分子平面性的增加,碰撞頻率溶劑分子以及DNA的減少[36]。結(jié)果表明,石竹烯可能插入DNA螺旋中的堿基對(duì)或位于DNA的疏水環(huán)境中,通過(guò)與DNA堿基的堆積相互作用可以穩(wěn)定復(fù)合物,從而增加DNA的熒光強(qiáng)度。

3 結(jié) 論

石竹烯存在于許多具有抗炎、抑菌、抑制哮喘功能的植物提取物中。較多學(xué)者對(duì)石竹烯研究局限于含有石竹烯的精油對(duì)微生物的抑制作用,但陳奕鵬等[37]簡(jiǎn)要說(shuō)明石竹烯對(duì)尖孢鐮刀菌、膠胞炭疽菌和多主棒孢菌具良好的抑制作用,即說(shuō)明石竹烯具有一定的抑菌作用。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平揭示究石竹烯對(duì)B.thermosphacta的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明：石竹烯能夠抑制B.thermosphacta的生長(zhǎng),使其細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性受到破壞,通透性增加,細(xì)胞內(nèi)容物如蛋白質(zhì)、鉀離子外滲,MDH、PK活力降低,影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)代謝。而且石竹烯可以與基因組DNA結(jié)合,破壞其結(jié)構(gòu)與構(gòu)象,抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

綠色、健康、無(wú)化學(xué)防腐劑添加的天然食品越來(lái)越受人喜愛(ài)。本實(shí)驗(yàn)探索石竹烯對(duì)于在真空包裝和冷藏條件下能生長(zhǎng)繁殖的B.thermosphacta的抑菌機(jī)理,表明石竹烯在食品中的應(yīng)用具有良好的潛力。為更有針對(duì)性的利用石竹烯作為天然防腐劑抑制食品腐敗菌,將繼續(xù)這一研究方向并探究石竹烯對(duì)不同菌種的抑菌機(jī)理。