（陜西學(xué)前師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 7100100）

當(dāng)母乳不能提供足夠營養(yǎng)時(shí)，需及時(shí)采用母乳替代品為嬰幼兒提供營養(yǎng)物質(zhì)。為確保母乳替代品中鈣磷比例適合嬰幼兒吸收[1]，生產(chǎn)廠家和質(zhì)監(jiān)部門需對(duì)母乳替代品中的鈣、磷含量進(jìn)行測(cè)定?，F(xiàn)行的做法是采取不同分析方法分別測(cè)量鈣、磷含量，需用到不同儀器，過程繁瑣、費(fèi)時(shí)，測(cè)量效率較低、人力成本較高。已有可同時(shí)測(cè)定鈣、磷含量的方法是電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[2-3]，但該類儀器價(jià)格昂貴，操作要求高[4]，不適合常規(guī)檢測(cè)。本文采用紫外可見分光光度法，通過控制鈣、磷測(cè)量條件，實(shí)現(xiàn)用同一方法不經(jīng)分離同時(shí)測(cè)量樣品中鈣磷含量，并用加標(biāo)回收率檢驗(yàn)[5]，結(jié)果滿意。該法準(zhǔn)確度高，操作方便快捷，測(cè)量成本低。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-8000S 紫外可見分光光度計(jì)（上海元析）；PHS-3C精密pH計(jì)（上海儀電）。

1.2 材料

樣品1（貝因美菁愛嬰兒配方奶粉0～6月齡，1段，貝因美嬰童食品股份有限公司，20190716）；樣品2（貝因美菁愛幼兒配方奶粉12～36月齡，3段，貝因美嬰童食品股份有限公司，20190915）；樣品3（亨氏超金健兒優(yōu)嬰兒營養(yǎng)米粉，亨氏聯(lián)合有限公司，20190730）。磷酸二氫鉀（天津科密歐）；碳酸鈣（上海山浦化工）；鉬酸銨（天津科密歐）；對(duì)苯二酚（天津科密歐）；亞硫酸鈉（西安天正康源）；鈣羧酸指示劑（天津科密歐）；三乙醇胺（天津科密歐）；乙醇（三明三圓）；醋酸，醋酸鈉（天津天力）；所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 吸收?qǐng)D譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取一組50 ml量瓶，標(biāo)為1號(hào)、2號(hào)，同時(shí)加入20 μg/ml鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液3 ml、50 μg/ml磷標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml，加入pH 5.4醋酸-醋酸鈉緩沖溶液10 ml，加入磷顯色系列溶液（50 mg/ml鉬酸銨溶液1 ml、200 mg/ml亞硫酸鈉溶液0.5 ml、5 mg/ml對(duì)苯二酚溶液0.5 ml），常溫下反應(yīng)30 min；2號(hào)量瓶加入鈣羧酸顯色劑5 ml，一并定容至50 ml，再反應(yīng)10 min，以空白溶液作參比，掃描鈣、磷顯色液吸收曲線并測(cè)定吸光度。平行測(cè)定5次，以吸光度為縱坐標(biāo)（y），磷或鈣的濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 最佳實(shí)驗(yàn)條件的篩選

研究指示劑/顯色劑加入順序、pH值、反應(yīng)時(shí)間、溫度等對(duì)鈣磷同時(shí)測(cè)定的影響。

2.2.1 指示劑/顯色劑加入順序?qū)ξ舛鹊挠绊懹绊懯覝叵拢?只50 ml量瓶，標(biāo)為a、b、c號(hào)，加入1 ml磷標(biāo)準(zhǔn)液，3 ml鈣標(biāo)準(zhǔn)液。a號(hào)同時(shí)加入鈣、磷顯色劑溶液，定容，反應(yīng)40 min后測(cè)定；b號(hào)先加入磷顯色劑溶液，反應(yīng)30 min后，加入鈣顯色劑溶液，定容，等待10 min，測(cè)定；c號(hào)先加入鈣顯色劑溶液反應(yīng)10 min后，加入磷的指示劑溶液，定容，反應(yīng)30 min后測(cè)定。

2.2.2 pH值對(duì)吸光度的影響 室溫下，取5只50 ml量瓶，加入鈣、磷標(biāo)準(zhǔn)液，先加入磷顯色劑溶液，又加入鈣顯色劑溶液，調(diào)節(jié)溶液pH分別為2.0，4.0，5.4，6.0，7.0，反應(yīng)后測(cè)量。

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響 室溫下，于50 ml量瓶中加入鈣、磷標(biāo)準(zhǔn)液，加入pH 5.4醋酸-醋酸鈉緩沖溶液10 ml，加入磷顯色劑溶液，反應(yīng)30 min后，加入鈣顯色劑溶液，定容，分別于反應(yīng)5，10，25，35，60，90，120 min測(cè)量。

2.2.4 溫度對(duì)吸光度的影響 選取15～30 ℃為研究區(qū)間，每隔5 ℃選取一個(gè)檢測(cè)點(diǎn)。于50 ml量瓶中加入磷標(biāo)準(zhǔn)液1 ml，鈣標(biāo)準(zhǔn)液3 ml，10 ml pH 5.4醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，在檢測(cè)溫度下，加入鈣磷顯色劑溶液，按要求反應(yīng)后進(jìn)行測(cè)量。

2.3 樣品測(cè)定

利用濕法消解[6-9]：取樣品0.6 g，置入錐形燒瓶，加入10 ml 硝酸:高氯酸（4:1）混合溶液，電熱爐上消解，待液體余2～3 ml時(shí)將樣品取下，冷卻。再加入10 ml混合酸，繼續(xù)加熱，若變黑則加入5 ml硝酸繼續(xù)消化，當(dāng)溶液變?yōu)闊o色或淡黃色后，消化完成[10-12]，轉(zhuǎn)入100 ml量瓶中定容，得消化稀釋樣品。

取兩份2 ml消化后的樣品，分別置入50 ml量瓶，標(biāo)為1號(hào)和2號(hào)。按2.1項(xiàng)所述方法操作，待反應(yīng)完成后測(cè)定。讀取710 nm處吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中磷含量；讀取2號(hào)量瓶556 nm處總吸光度及1號(hào)量瓶磷在該波長處的吸光度，做差得鈣在556 nm處的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中鈣含量。每種樣品平行測(cè)3組，計(jì)算消化稀釋樣品中鈣磷含量，換算為每100 g母乳替代品中鈣、磷量。

3 結(jié)果與分析

3.1 鈣、磷顯色吸收曲線比較

見圖1～3。磷在710 nm處產(chǎn)生強(qiáng)而穩(wěn)定的吸收帶（圖1），在該波長處鈣不產(chǎn)生吸收，故其吸光度可直接用于磷含量測(cè)定；鈣在556 nm處有最大吸收（圖2），吸光度隨波長急劇下降，在該波長處磷有弱吸收（圖3），故通過檢測(cè)556 nm處總吸光度并扣除磷的吸收，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)鈣的測(cè)定，據(jù)此實(shí)現(xiàn)對(duì)同一樣品中鈣、磷的快速連續(xù)測(cè)定。

圖1 磷顯色吸收曲線

圖2 鈣顯色吸收曲線

圖3 磷、鈣同時(shí)測(cè)定顯色吸收曲線

3.2 最佳實(shí)驗(yàn)條件篩選

3.2.1 顯色劑加入順序?qū)ξ舛鹊挠绊?顯色劑加入順序?qū)︹}的吸光度影響較小，對(duì)磷的吸光度影響較大（見圖4），實(shí)驗(yàn)中先加入磷系列顯色溶液使其充分反應(yīng)后加入鈣顯色劑時(shí)，測(cè)量鈣、磷的吸光度均獲得理想值。

3.2.2 pH值對(duì)吸光度的影響 pH 5.4時(shí)鈣的吸光度最高，磷的吸光度受pH影響較?。ㄒ妶D5），故通過加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液控制體系pH值為5.4。

3.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響 磷和顯色劑反應(yīng)30 min吸光度趨于穩(wěn)定，并在鈣與顯色劑反應(yīng)10 min后，鈣磷吸光度均達(dá)峰值（見圖6）。

3.2.4 溫度對(duì)吸光度的影響 15～35 ℃區(qū)間溫度變化對(duì)磷的吸光度影響有限，鈣的吸光度在25 ℃時(shí)達(dá)最高（見圖7），實(shí)驗(yàn)選擇在室溫25 ℃測(cè)定。

圖4 試劑加入順序?qū)ξ舛扔绊?/p>

圖5 pH值對(duì)吸光度的影響

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響

圖7 溫度對(duì)吸光度的影響

3.3 磷與鈣的標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

按2.2項(xiàng)方法繪制磷和鈣的標(biāo)準(zhǔn)曲線，磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.01x-0.0257，R2=0.9990；鈣的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.001x+0.0497 ，R2=0.9998。結(jié)果表明，磷和鈣的濃度分別在0.3～1.7，0.4～2 μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

4 樣品分析結(jié)果

4.1 磷與鈣的測(cè)定值

結(jié)果見表1～2。

表1 母乳替代品中磷含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

表2 母乳替代品中鈣含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

4.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取2 ml樣品消化稀釋液，置入50 ml量瓶，加入15 μg/ml磷標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml，顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算磷含量和回收率，結(jié)果磷回收率為96.7 %～112.3 %；按同樣方法，于樣品中加入20 μg鈣，進(jìn)行鈣加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果鈣回收率為97.2 %～ 108.4 %。結(jié)果表明該法準(zhǔn)確可靠。

5 結(jié)論

本研究利用雙波長分光光度法，建立一種不經(jīng)分離即可對(duì)樣品中鈣、磷含量同時(shí)測(cè)定的新方法。結(jié)果表明，該法準(zhǔn)確、便捷，所用儀器簡單。利用此法可實(shí)現(xiàn)對(duì)母乳替代品中鈣磷比進(jìn)行快速檢測(cè)，給乳制品生產(chǎn)廠家和質(zhì)監(jiān)部門提供新的選擇。

用該法對(duì)市面上常見母乳替代品進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果表明，樣品3鈣磷比為1.6:1，最接近母乳中鈣磷含量（2:1）。樣品1和2的鈣磷比分別為1.5:1和1.4:1，鈣比例較低，建議在沒有母乳的情況下，科學(xué)增加?jì)胗變衡}的攝入。