林嫚婷，蘇亞霞，胡漢昆

（武漢大學(xué)中南醫(yī)院（武漢大學(xué)第二臨床學(xué)院），湖北 武漢 430071）

抗生素已被廣泛用于預(yù)防和治療人類及動物的感染性疾病。但濫用抗生素會誘使細菌產(chǎn)生耐藥性,對人體產(chǎn)生毒副作用,導(dǎo)致二重感染，從而威脅到人類的健康。由于農(nóng)業(yè)的日益發(fā)展和畜牧業(yè)的集約化，大量獸用抗生素被用于預(yù)防和治療動物疾病，或是用作動物體重增長促進劑[1-2]。而這些動物的排泄物、養(yǎng)殖業(yè)的排污等又會污染土壤和水質(zhì)，導(dǎo)致野生動植物體內(nèi)的抗生素累積。此外，有些商戶會將抗生素直接添加到食物中，如添加到牛奶中以延長其新鮮度[3]。如果不加以控制，人類長期低劑量地接觸抗生素很可能會導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生，并在人群和動物群中互相傳遞。

因此，為了最大限度地減少人類接觸抗生素，歐、美等國家的監(jiān)管機構(gòu)都出臺了一系列法規(guī)，要求嚴格控制食物中抗生素的殘留量，這就需要依靠準確、靈敏的分析方法確定食物中的抗生素類別和殘留量。本文對近年食品中抗生素殘留的前處理及檢測方法進行綜述，并對未來發(fā)展趨勢提出展望，以冀為食品中抗生素殘留監(jiān)測方法的完善提供參考。

1 樣品預(yù)處理技術(shù)

1.1 固相萃?。⊿PE）

SPE是痕量分析中最常用的樣品純化工具之一，它是基于液-固色譜分配原理，通過選擇性吸附、選擇性洗脫對樣品中目標分析物進行分離、純化和富集。該技術(shù)通常是將樣品溶液加載至吸附劑上，保留其中的目標分析物，再用適當?shù)娜軇┫慈ルs質(zhì)后，用少量不同的溶劑洗脫目標分析物，或選用合適的溶劑直接選擇性洗脫目標分析物，也可在加載樣品溶液時，選擇性吸附其中的干擾雜質(zhì)，使目標分析物直接流出，從而達到快速分離、凈化與濃縮的目的。其中，萃取溶劑和固體吸附劑可根據(jù)分析物的不同來選擇。Hawari等[4]使用以N-丙基乙二胺（PSA）為吸附劑的SPE柱，提取蜂蜜中幾種不同極性的抗生素殘留物（磺胺類，四環(huán)素類，大環(huán)內(nèi)酯類，林可酰胺類和氨基糖苷類），發(fā)現(xiàn)甲醇是提取蜂蜜中各種抗生素殘留物最有效的溶劑，分析物的回收率為85 %～111 %。Feng等[5]采用固相萃取技術(shù)提取并測定了不同蔬菜樣品中的11種抗生素（包括4種磺胺類藥物，2種四環(huán)素類藥物，3種氟喹諾酮類藥物，泰樂菌素和氯霉素），并比較了Oasis HLB、C18、NH23種SPE柱，結(jié)果表明HLB柱的回收率最高，11種抗生素的平均回收率為71.4 %～104.0 %。該方法凈化效果優(yōu)于液-液萃取，檢測靈敏度高，但是成本較高，需根據(jù)檢測目的更換不同的吸附劑，且批次間的重復(fù)性難以保證。

1.2 QuEChERS方法

QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）方法是Anastassiades教授于2003年開發(fā)的一種用于快速測定產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量的樣品前處理技術(shù)[6]，近年在國際上得到了一致認可和廣泛應(yīng)用，其原理與高效液相色譜（HPLC）和SPE相似，都是利用吸附劑與雜質(zhì)的相互作用，選擇性吸附雜質(zhì)從而達到凈化樣品的目的?；静襟E是先用乙腈提取分離，再用氯化鈉、硫酸鎂鹽析除去樣品中的水和蛋白質(zhì)，然后再添加SPE填料吸附劑除雜，離心得到的上清可直接進行檢測。與傳統(tǒng)的SPE相比較，QuEChERS具有耗時少、回收率高、操作簡便、準確度高等優(yōu)點，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜等植物性食品及蜂蜜、牛奶等動物性食品的提取凈化。Wang等[7]采用多種優(yōu)化的QuEChERS方法提取牛奶中的紅霉素、青霉素G、鹽酸四環(huán)素、磺胺甲惡唑、鹽酸環(huán)丙沙星和青霉素V殘留并進行測定，6種抗生素殘留的最大回收率均＞80 %，在最佳預(yù)處理條件下，最大回收率達84.18 %～115.99 %。Yu等[8]采用QuEChERS方法同時提取多葉蔬菜中的多種抗生素，結(jié)果表明該法能有效地從葉類蔬菜中提取所有目標抗生素，20種抗生素的平均回收率為57 %～91 %。雖然QuEChERS方法靈活，但每種抗生物殘留的提取都需進行相應(yīng)的優(yōu)化（如鹽的類型、數(shù)量及吸附劑的體積等），才能得到滿意的回收率。

1.3 基質(zhì)固相分散萃取（MSPD）

MSPD方法是將固體、半固體和黏性樣品與涂漬有C18等多種聚合物的吸附劑材料一起研磨得到半干的均勻混合物，并將其作為填料裝入萃取柱中，然后用不同的溶劑淋洗，將各種目標化合物洗脫下來，目前廣泛應(yīng)用于各種固體和半固體食品中分析物的提取純化。Sun等[9]制備了一系列新型虛擬分子印跡聚合物（DMIP），作為氟喹諾酮類的高選擇性吸附劑，并將制備的DMIP應(yīng)用于MSPD，從魚類樣品中選擇性提取8種氟喹諾酮類抗生素殘留，回收率為64.4 %～102.7 %。Bogialli等[10]也在分析奶酪中四環(huán)素類抗生素殘留的研究中發(fā)現(xiàn)，在MSPD技術(shù)中，熱水是一種有效的萃取劑，其絕對回收率不低于78 %。該方法省去了傳統(tǒng)樣品前處理中的樣品勻化、組織細胞裂解、提取、凈化等重復(fù)離心、過濾、萃取過程，可直接進行提取和凈化，從而縮短整體分析時間并減少萃取溶劑的消耗，也避免了樣品的損失，但吸附劑目前不可重復(fù)使用。

1.4 加壓液體萃取（PLE）

PLE是在較高的溫度和壓力下用有機溶劑對固體或半固體樣品進行萃取的自動化方法，其中升高的溫度加速萃取動力學(xué)，升高的壓力使溶劑的溫度保持在其沸點以下。該方法快速、基質(zhì)影響小、回收率高、重現(xiàn)性好且減少了有毒有機溶劑的用量。Jiménez[11]等分析雞蛋基質(zhì)中41種抗生素殘留物時，在70 ℃下用乙腈和琥珀酸緩沖液（pH 6.0）混合溶劑（1:1）進行PLE，得到的提取物可直接進行色譜分析。但在大部分食品基質(zhì)的預(yù)處理過程中，PLE后通常還需進一步進行固相萃取。

1.5 微波輔助萃取（MAE）

MAE是利用微波能加熱，根據(jù)不同物質(zhì)吸收微波能力的不同將目標化合物從樣品中分離出來的一種新型萃取技術(shù)。該技術(shù)通過微波強化，縮短了提取時間，提高了提取率、降低了成本且減少了溶劑用量，是一種綠色環(huán)保的提取技術(shù)。但采用MAE對食品基質(zhì)進行預(yù)處理時，常常需要聯(lián)合SPE等其他技術(shù)才能獲得干凈的提取物。Huang等[12]測定魚類中6種抗生素殘留時采用微波輔助萃取-固相純化-分散液相微萃?。∕AE-SPP-DLLME）進行分離提純，在最佳條件下，觀察到所有目標分析物的良好線性（r＞0.9991）和滿意的回收率（回收率＞87 %），與單純的微波輔助提取和純化相比，該方法觀察到的基質(zhì)效應(yīng)明顯降低。

總之，從食品基質(zhì)中提取抗生素殘留有多種不同方法，但采用什么方法還需根據(jù)具體情況進行判斷，不同的食物、不同種類的抗生素采用的方法各有不同。若樣本量大且無需準確定量，則首要考慮時間成本，選擇操作簡便的預(yù)處理方法；若是需要對各類抗生素殘留準確定量，可能需要聯(lián)用幾種預(yù)處理方法，保證各類抗生素殘留的有效提取并去除基質(zhì)效應(yīng)。

2 抗生物殘留的檢測方法

檢測食品中抗生素殘留的分析方法可分為兩大類，即篩選方法和確證方法。篩選方法是指能檢測分析物或一類分析物的存在并確定其是否符合法規(guī)規(guī)定的方法[13]，可提供定性、半定量或定量結(jié)果，主要用于大量樣本的分析，其理想目標是低錯誤率、高通量、操作簡便、分析時間短、選擇性好、成本低。確證方法則需準確分析抗生素殘留的種類和含量，在定量方面比篩選方法更可靠。目前，篩選方法主要包括薄層色譜法（TLC）、HPLC、毛細管電泳（CE）、生物傳感器、微生物測定法和免疫分析法等，確證方法主要為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）。

2.1 TLC

TLC是將支持劑涂布于支持板上作為固定相，配制合適的溶劑作為流動相，通過流動相流過固定相時產(chǎn)生重復(fù)的吸附、解吸附，對混合樣品進行分離、定性鑒別和定量檢測的一種層析分離技術(shù)。由于其操作簡單、適用范圍廣、速度快、成本低，目前已經(jīng)成為最受歡迎和廣泛使用的抗生素篩選方法之一。但仍存在對于復(fù)雜樣品分離效能較差、靈敏度較小、不易進行定量分析等缺點。Ramirez等[14]開發(fā)了一種通過高效薄層色譜（HPTLC）結(jié)合生物自顯影技術(shù)鑒定和定量牛奶中多種抗生素殘留（氯霉素，氨芐西林，芐青霉素，雙氯西林和紅霉素）的分析方法，回收率為90 %～100 %，該方法的靈敏度較好，保證了上述抗生素的檢測水平低于牛奶允許的最大殘留限量（MRL），且能減少有機溶劑的使用，大幅降低成本。

2.2 HPLC

HPLC具有“四高一廣”的特點：高壓、高速、高效、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣。除此之外，它所需的樣品量少，測定精密度高，因此也廣泛應(yīng)用于食品中抗生素殘留的篩選和定量。Guo等[15]采用HPLC（C18柱，215 nm檢測波長）同時測定牛奶中的克拉維酸和他唑巴坦，均表現(xiàn)出良好的線性（R2＞0.9988），克拉維酸的回收率為81.953 %～87.688 %、RSD為0.975 %～1.248 %，他唑巴坦的回收率為85.007 %～92.991 %、RSD為0.872 %～1.650 %。Khanal等[16]采用快速篩查試劑盒與HPLC分析檢測了尼泊爾加德滿都谷地鮮奶中的青霉素和磺胺類藥物，結(jié)果顯示液相色譜法精確性和準確性更高，能檢測出更多的陽性樣品。但采用HPLC進行多種抗生素殘留的測定時還需考慮檢測器的選擇，以大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為例，該類抗生素的吸收光譜多在紫外末端區(qū)，缺乏特征紫外吸收，不適合采用紫外檢測器進行檢測，而熒光衍生化易導(dǎo)致紅霉素分解，又限制了熒光檢測器的應(yīng)用。因此，在多種抗生素殘留的分析中，根據(jù)各種抗生素的特征選擇合適的檢測器對于建立高靈敏度的分析方法至關(guān)重要。

2.3 CE

近年，CE已被證明是一種強大的分離技術(shù)，通常采用石英作毛細管柱，通過施加高壓直流電場，根據(jù)分子在電場中的不同遷移來達到分離目的，目前已實現(xiàn)與HPLC相似的靈敏度、選擇性和特異性。相對高的效率，快速的分析時間及溶劑和樣品的低消耗使CE成為環(huán)境友好的檢測技術(shù)。Dai等[17]建立了一種基于CE和在線化學(xué)發(fā)光檢測（CL），使用Ag（III）絡(luò)合物作為氧化劑的食品中磺胺類藥物殘留測定方法，磺胺二甲嘧啶（SDD）、磺胺嘧啶（SDZ）和磺胺噻唑（STZ）的檢出限分別為2.75，3.14，0.65 μg/ml，并成功應(yīng)用于豬肉、雞肉和牛奶樣品中的3種磺胺類藥物殘留的同時測定。然而，使用CE測定痕量殘留物的缺點之一，是由于樣品進樣體積較小及毛細管上檢測的光學(xué)路徑長度較短，導(dǎo)致其靈敏度較低。

2.4 生物傳感器

生物傳感器是廣泛應(yīng)用于食品安全、疾病檢測、藥物發(fā)現(xiàn)等多個領(lǐng)域的一種新方法，由兩個主要部分組成：生物感受器或生物識別元件及傳感器，用于識別目標分析物并將識別事件如分析物濃度轉(zhuǎn)換為可測量的信號。主要包括電化學(xué)傳感器、光學(xué)傳感器、重力生物傳感器和熱傳感器。由于其具有特異性高、分析速度快、操作簡便、高樣品通量且檢測限符合法規(guī)限制等優(yōu)點，適用于食品中抗生素殘留的篩選。Thompson等[18]開發(fā)了一種利用生物傳感器技術(shù)的篩選方法，用于牛、綿羊和豬的腎中酰胺醇類抗生素甲砜霉素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺的檢測，均能檢測低于其各自1/2 MRL的低濃度。為了達到理想的生物篩選條件，未來還需繼續(xù)開發(fā)更加高效、經(jīng)濟的生物傳感器，不僅要提高其靈敏度、特異性，還要結(jié)合納米技術(shù)以優(yōu)化其性能并提供便攜性。

2.5 微生物測定法

微生物測定法主要是根據(jù)微生物由于抗生素作用表現(xiàn)出的生理機能、代謝、抑制程度等變化來定性、定量地檢測出樣品內(nèi)的抗生素殘留，具有檢測可靠性高、操作便捷、成本低的特點，并存在一定的特異性。Tumini等[19]設(shè)計了一種微生物測定法，以短小芽孢桿菌孢子包被微量滴定板，通過觀察其微生物抑制情況檢測牛奶中四環(huán)素的濃度與MRL，通過5 h內(nèi)指示劑（亮黑色甲苯胺藍）顏色的變化，檢測到117 μg/L金霉素、142 μg/L土霉素和105 μg/L四環(huán)素，顯示出良好的特異性（97.9 %）。但微生物測定法不能準確定量，且有些實驗得到結(jié)果耗時長。

2.6 免疫分析法

免疫分析法是基于抗體與抗原或半抗原之間特異性反應(yīng)建立的一種高選擇性生化分析方法，根據(jù)標記的不同主要分為熒光免疫分析技術(shù)、放射免疫分析技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)和發(fā)光免疫分析技術(shù)。由于具有高度靈敏性和高度特異性，大大簡化了測量過程，短時間內(nèi)可檢測大量樣品，可應(yīng)用于食品抗生素殘留的篩選。Luo等[20]成功開發(fā)了一種快速靈敏的化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法（CLIEA）,用于牛奶中新霉素殘留分析，樣品的平均回收率為88.5 %～105.4 %，檢出限為9.4 μg/kg。不過，該方法多用于篩選并判斷其是否高于檢測限，進一步定量還需依靠LC或LC-MS來進行，且免疫分析法相對容易受到干擾，還存在假陽性、交叉反應(yīng)性等局限性。

2.7 LC-MS

LC-MS結(jié)合了色譜的高分離效能和質(zhì)譜的定性功能，是迄今為止在任何類型的生物基質(zhì)中確認抗生素身份的最重要技術(shù)。幾乎所有的抗生素都是極性和/或熱不穩(wěn)定的化合物，因此采用LC比氣相色譜法（GC）更適合。許多國家的公共衛(wèi)生機構(gòu)依靠MS檢測對食品中的抗生素進行確認，目前多采用電噴霧電離（ESI）或大氣壓化學(xué)電離（APCI）作為離子源。Shendy等[21]采用LC-MS/MS[四級桿復(fù)合線性離子阱（QTrap）串聯(lián)質(zhì)譜儀，ESI正離子模式]測定蜂蜜中的硝基呋喃代謝物和硝基咪唑的殘留量，回收率為90.96 %～104.80 %，重復(fù)性和實驗室再現(xiàn)性的變異系數(shù)（CV）分別為1.35 %～5.10 %和2.65 %～12.58 %，硝基呋喃代謝物的確定限（CCα）和檢測容量（CCβ）分別為0.12～0.31 μg/kg和0.21～0.53 μg/kg，而硝基咪唑的CCα和CCβ分別為0.53～0.74 μg/kg和0.91～1.27 μg/kg。Dubreil等[22]采用LC-MS/MS（ESI正離子模式）對肉類和水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品中75種抗生素進行檢測，能鑒定出其中的73種抗生素。LC-MS分離效能強、特異性好、靈敏度高，能同時進行定性和定量測定，是目前比較理想的檢測手段。

3 展望

食品中抗生素殘留檢測的難題在于樣品基質(zhì)的復(fù)雜性及檢測方法的靈敏度，因此目前研究大多集中于如何優(yōu)化樣品提純、凈化的方法及提高檢測方法靈敏度，但這些方法大多都有其局限性。如何有效地改良優(yōu)化SPE技術(shù)，使之能更好地提純凈化食品基質(zhì)中的抗生素殘留是未來一大研究方向，研究重點可放在吸附劑材料的開發(fā)上。Ye等[23]合成了一種新型的富含氟、硼的吸附劑（FBA），并將其作為磁性固相萃取的萃取相，這種吸附劑不僅具有較強的磁響應(yīng)性和較好的使用壽命，且可與HPLCDAD結(jié)合，對環(huán)境水和牛奶中的痕量氟喹諾酮類抗生素進行靈敏的定量。此外，還可開發(fā)多功能吸附劑以簡化萃取步驟、提升萃取質(zhì)量?；|(zhì)固相分散萃取同樣存在吸附劑性能的問題，目前已開發(fā)出分子印跡聚合物（MIP）、碳納米管-分子印跡聚合物（CNT-MIP）、苯基三氧硅烷-氧化鎂（PTSMgO）、金屬有機骨架（MOF）等多種新型吸附劑，用于各種復(fù)雜基質(zhì)中的特定化合物提取[24]。Wang等[25]合成了一種新型混合模板分子印跡聚合物，可同時識別8種氟喹諾酮類、8種磺胺類和4種四環(huán)素類化合物，回收率達92 %以上，并用于建立同時提取豬肉中20種抗生素的基質(zhì)固相分散萃取方法。目前仍迫切需要開發(fā)出具有可重復(fù)使用性的吸附劑材料，而磁性納米顆粒是當前較有希望的可重復(fù)使用材料，有待深入研究。另外，生物傳感器的應(yīng)用發(fā)展十分迅速，如何提高靈敏度、降低成本、增加便攜性以推廣應(yīng)用也是研究的重點。通過不斷改進生物感受器（生物識別元件），相信能不斷地促進篩選方法的發(fā)展，滿足檢測需要。而色譜技術(shù)的不斷優(yōu)化和MS技術(shù)的不斷發(fā)展也為痕量分析提供了強有力的幫助，不斷提高食品抗生素殘留的定性定量分析水平。