張樹山，戴建軍，吳彩鳳，孫玲偉，韓雪峻，姜紅菊，張德福?

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室，上海201106；2 上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海201302)

張樹山，戴建軍，吳彩鳳，等.成年克隆豬肺臟差異蛋白的鑒定與功能分析[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，36(4)：65-70

體細(xì)胞核移植(即克隆，Somatic cell nuclear transfer，SCNT)技術(shù)在豬上獲得成功以來，尤其是與轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合后，在豬新品種培育和人類醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，并成為生命科學(xué)領(lǐng)域的重要研究熱點(diǎn)之一[1-3]。 然而，一些成活克隆豬常伴有表型異常和不同程度的器官發(fā)育缺陷，一定程度上制約了豬體細(xì)胞克隆技術(shù)研究的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用[4-5]，故迫切需要闡明核移植操作對(duì)克隆豬發(fā)育的影響機(jī)制。從相關(guān)研究現(xiàn)狀來看，探索該機(jī)制目前主要有分子水平和蛋白質(zhì)組學(xué)水平研究?jī)煞N途徑。 在分子水平上，許多研究者從DNA 甲基化和乙?；缺碛^遺傳學(xué)角度在牛和豬上做了較多的研究工作，認(rèn)為克隆動(dòng)物常伴有不同程度的發(fā)育缺陷，其原因主要是核移植克隆中供體細(xì)胞表觀遺傳修飾重編程的穩(wěn)定性較差[6-7]。 在蛋白質(zhì)水平上，前人分別對(duì)克隆牛和豬的胎盤[8-10]、死亡克隆豬臍帶的上皮細(xì)胞[5]、成年克隆豬的胰腺蛋白[4，11]及克隆豬的心臟蛋白進(jìn)行了大量研究，為準(zhǔn)確闡明克隆動(dòng)物的器官發(fā)育異常的形成機(jī)制提供了新的線索。 目前，關(guān)于克隆豬肺臟蛋白的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。 據(jù)此，本研究擬利用現(xiàn)已成熟的雙向電泳-質(zhì)譜體系的比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，以本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的成年克隆豬和正常繁殖豬為研究對(duì)象，對(duì)二者的肺臟差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定與功能分析，以期為揭示SCNT 操作對(duì)成活克隆豬的影響機(jī)制提供新的線索和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺、甘氨酸、TRIS 等購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，乙醇、乙酸和甲醛等為國(guó)產(chǎn)分析純。 Protein assay reagent 試劑盒、pH 3—10 干膠條購(gòu)自美國(guó)伯樂公司(Bio-Rad)。 β-Actin 和GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司。

主要儀器有Dounce's 勻漿器(美國(guó)Kimble 公司)；U2800 紫外分光光度計(jì)(日本Hitachi 公司)；雙向電泳凝膠系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司)；PDQuest 8.0 圖像分析軟件(美國(guó)Bio-Rad 公司)；UMAX 掃描儀(中國(guó)臺(tái)灣世成科技股份有限公司)；4800 串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(4800 Plus MALDI TOF∕TOF，美國(guó)SCIEX 公司)；Trans-Blot Turbo 轉(zhuǎn)印儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集與保存

肺臟組織蛋白樣品分別采集自3 頭成年體細(xì)胞克隆豬(7 月齡巴馬小型豬，雄性)和3 頭同品種、同性別、年齡相近的正常繁殖豬(對(duì)照)。 肺肌樣品經(jīng)生理鹽水沖洗干凈后切成小塊置于凍存管，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室移入液氮( -196 ℃)中冷凍保存。 蛋白樣品提取、分離和Western blot 驗(yàn)證在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所胚胎工程實(shí)驗(yàn)室完成，雙向電泳和質(zhì)譜鑒定委托上海中科新生命公司完成。

1.3 解剖觀察

樣品采集過程中，分別對(duì)克隆豬與對(duì)照豬肺臟組織進(jìn)行觀察、解剖分析。

1.4 蛋白質(zhì)樣品的制備

蛋白提取：取大約300 mg 解凍肺臟組織樣，加入PBS 清洗，切碎成1 mm3小塊移至Dounce's 勻漿器中，加入DIGE 裂解液(DIGE 裂解液和酶抑制劑體積比50∶1)約1 mL，在冰上勻漿處理20 次。 將勻漿液經(jīng)超聲破碎處理后離心(12 000g，45 min)，取上清。

使用Protein assay reagent 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雙向電泳(2-DE)、凝膠染色和圖像分析

雙向電泳方法參照Park 等[11]并作調(diào)整。 含量為100 μg 的樣品與水化上樣緩沖液(尿素8 mol∕L，2%CHAPS，0.5% IPG 緩沖液，DTT 18 mmol∕L，并加0.001%溴酚藍(lán))充分混合。 使用pH 3—10 非線性膠條進(jìn)行電泳。 電泳條件：30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 8 h，500 V 4 h)；SDS-PAGE 電泳：為12.5%的膠(15 mA∕膠30 min，30 mA∕膠，至溴酚藍(lán)離膠下沿0.5 cm)。

蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜采用Image Master 2D Platinum 軟件進(jìn)行圖像分析，預(yù)測(cè)蛋白點(diǎn)分子量和等電點(diǎn)，并比較差異蛋白點(diǎn)。

1.6 膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜檢測(cè)

選擇雙向電泳膠上具有表達(dá)差異(2 倍以上)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶切、MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜分析，每個(gè)差異蛋白點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3 次。

1.7 Western blot 驗(yàn)證

預(yù)染Marker 和蛋白樣品上樣量分別為10 μL 和20 μg，12%聚丙烯酞胺凝膠、120 V 恒壓電泳1.0 h，電泳緩沖液處理后的PVDF 膜在轉(zhuǎn)膜儀上恒流轉(zhuǎn)膜。 取出在封閉液(TBST 液加0.1% Tween-20 和5%脫脂奶)孵育1 h，加Ⅰ抗(抗兔β-actin 和內(nèi)參GAPDH 抗體，均為1∶5 000)后4 ℃過夜。 利用TBST 液漂洗、加Ⅱ抗的TBST 液室溫下孵育和TBST 液漂洗。 將光液均勻滴于膜上，暗室條件下反應(yīng)、顯影和定影，清水沖凈晾干。 掃描并利用凝膠成像分析系統(tǒng)軟件定量分析灰度值，根據(jù)內(nèi)參蛋白GAPDH 的灰度值確定目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用Mascot 搜索引擎進(jìn)行蛋白檢索和比對(duì)，并結(jié)合NCBInr 和Swissprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行綜合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆豬肺臟差異蛋白的2-DE 凝膠表達(dá)譜

從1 000 多個(gè)差異蛋白中選擇表達(dá)量差異在2 倍以上的共計(jì)26 個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜鑒定，雙向電泳(圖1)和質(zhì)譜(表1)鑒定結(jié)果表明，克隆豬與非克隆豬的肺臟差異蛋白的等電點(diǎn)為4—10、相對(duì)分子質(zhì)量為9—130 ku 。 22 個(gè)上調(diào)蛋白中除3#、6#、14#、15#、20#和21#蛋白外，其余均為酸性蛋白；4 個(gè)下調(diào)蛋白中24#和25#為堿性蛋白，其余2 個(gè)為酸性蛋白。 所有分離差異蛋白的pH 為4—10。 β-肌動(dòng)蛋白的Western blot 驗(yàn)證結(jié)果表明，本試驗(yàn)中質(zhì)譜鑒定結(jié)果是較可靠的(圖2)。

表1 成年克隆豬肺臟差異表達(dá)蛋白情況Table 1 Differential expression of lung proteins in adult cloned pigs

2.2 克隆豬肺臟差異蛋白的生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)Gene Ontology(GO)方法對(duì)差異蛋白功能進(jìn)行分析表明，與同品種、同齡和同性別正常繁殖豬相比，體細(xì)胞克隆豬肺臟的抗氧化相關(guān)、免疫能力等相關(guān)蛋白的表達(dá)水平上均存在較大差異(圖1 和表1)。

26 個(gè)差異表達(dá)蛋白的主要分子功能分屬8 類(圖3 左)。 多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白1(4#)和抑微管裝配蛋白(13#)分別為翻譯調(diào)節(jié)和分子傳感器活性蛋白；催化活性蛋白包括核糖-5-磷酸異構(gòu)酶(3#)、鐵蛋白重鏈(5#)、超氧化物歧化酶2(14#)、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(16#)、過氧化物酶5(19#)、L-乳酸脫氫酶A鏈(20#)、線粒體異檸檬酸脫氫酶α 亞基(21#)和過氧化物還原酶-2(26#)等；酶活性調(diào)節(jié)蛋白包括增殖細(xì)胞核抗原(2#)、胱抑素-A8(10#)、胱抑素B 蛋白(11#)、胱抑素-B(12#)和過氧化物還原酶-2(26#)等；抗氧化活性蛋白包括超氧化物歧化酶2(14#)、白蛋白(18#)、血紅蛋白α 亞基(25#)和過氧化物還原酶-2(26#)等；轉(zhuǎn)運(yùn)活性蛋白包括血紅蛋白β-亞基(7#)和血紅蛋白α 亞基(25#)；結(jié)構(gòu)分子活性蛋白有胱抑素-A8(10#)、胱抑素B 蛋白(11#)、胱抑素-B(12#)、線粒體異檸檬酸脫氫酶α 亞基(21#)和60S 核糖體蛋白L22(22#)等；除核糖-5-磷酸異構(gòu)酶(3#)、血紅蛋白β-亞基(7#)和免疫球蛋白γ-4 鏈C 區(qū)(6#)外，均具有連接蛋白功能。 差異蛋白的細(xì)胞組分分類表明(圖3 右)，本試驗(yàn)中相關(guān)蛋白主要分布在細(xì)胞區(qū)域(19%)和細(xì)胞器(17%)中。

3 討論

肺臟發(fā)育異常在成活克隆動(dòng)物中較為常見，如世界首例克隆羊多莉早夭原因之一便是肺部感染，Hill等[13]、李世杰等[14]均報(bào)道了新生死亡克隆牛中有較高比例的肺臟發(fā)育異常。 本研究中解剖分析也發(fā)現(xiàn)，3 頭克隆豬均存在不同程度的肺臟發(fā)育異常。 本研究利用雙向電泳-質(zhì)譜方法對(duì)克隆豬肺臟差異蛋白進(jìn)行分離和鑒定，并借助生物信息學(xué)方法對(duì)部分重要的蛋白進(jìn)行了逐一分析。

3.1 抗氧化相關(guān)蛋白

氧自由基(即活性氧，ROS)生成-消除的動(dòng)態(tài)平衡的打破對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大影響。 ROS 積聚會(huì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、激活細(xì)胞凋亡通路甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]，故抗氧化活性蛋白一直是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的熱點(diǎn)之一。

線粒體中的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一類抗氧化酶，能通過催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)減輕超氧陰離子自由基(O2-)對(duì)機(jī)體的損害[16]。 其中的超氧化物歧化酶2(SOD2 或Mn-SOD，14#)被認(rèn)為是氧化應(yīng)激反應(yīng)因子，是能清除ROS 的最重要抗氧化酶之一，且其對(duì)體內(nèi)氧化應(yīng)激較敏感，表達(dá)水平隨著發(fā)生氧化應(yīng)激即刻上調(diào)[17-18]。 早期研究發(fā)現(xiàn)，SOD2 的過表達(dá)可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，在人肺癌腫瘤細(xì)胞上也得到了證實(shí)[17-18]。 本研究中，克隆豬肺組織中SOD2 過表達(dá)，可能是應(yīng)對(duì)肺細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的適應(yīng)性改變。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中鐵儲(chǔ)存蛋白主要有鐵蛋白重鏈(Ferritin heavy chain，F(xiàn)HC，5#)和鐵蛋白輕鏈(Ferritin light chain)2 個(gè)亞基類型[19-20]。 兩種鐵儲(chǔ)存蛋白中，只有FHC 具有亞鐵氧化酶活性，能參與亞鐵離子(Fe2+)轉(zhuǎn)化為三價(jià)鐵(Fe3+)，從而抑制了二價(jià)鐵參與的芬頓反應(yīng)，最終抑制細(xì)胞內(nèi)羥自由基的產(chǎn)生。研究已證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)FHC 表達(dá)上調(diào)可能是機(jī)體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的急性期反應(yīng)[21]。 本研究中，克隆豬的肺中FHC 過表達(dá)可能也是類似原因[21-22]。

過氧化物酶家族(Peroxiredoxins，PRDXs)屬于抗氧化蛋白超家族，廣泛存在于原核和真核生物中。PRDXs 包括Prx I、Prx II、Prx III、Prx IV、Prx V 和Prx VI 等6 個(gè)抗氧化蛋白，具有抑制胞內(nèi)過氧化氫累積功能，不僅能降低細(xì)胞遭受氧化性損傷程度，也能通過調(diào)節(jié)過氧化氫水平實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)通路的調(diào)控[23-24]。 本研究中的Prdx5(19#)和Prdx2(26#)均是典型的含有2 個(gè)Cys 殘基的過氧物酶。 PRDX2 具有能抑制過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡的功能[25]。 Prdx5 也是一個(gè)重要的抗氧化酶，在降低細(xì)胞內(nèi)氧代謝生成的活性氧水平方面發(fā)揮重要作用。 在本研究中，低表達(dá)的Prdx2 和高表達(dá)的Prdx5 可能是細(xì)胞對(duì)較高水平過氧化氫的一種自發(fā)反應(yīng)。

3.2 其他蛋白

本研究中，其他重要差異表達(dá)蛋白主要涉及翻譯調(diào)節(jié)活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、催化活性、酶調(diào)節(jié)劑活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性和結(jié)構(gòu)分子活性等。

增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA，2#)定位在真核細(xì)胞核內(nèi)，不僅是DNA 復(fù)制過程的必需因子之一，也參與了DNA 復(fù)制后修復(fù)[26-27]。 在醫(yī)學(xué)疾病診斷上，PCNA 的表達(dá)水平被認(rèn)為是細(xì)胞增殖狀態(tài)的評(píng)價(jià)指數(shù)[28-29]。 本研究中，克隆豬肺蛋白中PCNA 表達(dá)水平顯著高于正常繁殖豬，其原因可能是克隆豬肺細(xì)胞內(nèi)存在較多的DNA 復(fù)制后修復(fù)。

核糖體蛋白質(zhì)與核糖體RNA 共同組成了核糖體，是合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器。 其中的60S 核糖體蛋白L22(60S ribosomal protein L22，RPL22，22#)也具有核糖體外功能，如DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、 RNA 剪接和修飾，以及細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和凋亡調(diào)控等[30-31]。 早期研究認(rèn)為，RPL22 也與一些遺傳疾病相關(guān)[16]。 本研究推測(cè)RPL22 表達(dá)上調(diào)是豬肺器官正常生長(zhǎng)發(fā)育的不利因素。

細(xì)胞骨架與細(xì)胞遷移、細(xì)胞分裂等細(xì)胞進(jìn)程及基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)，其基本成分之一為肌動(dòng)蛋白(Actin)。 作為Actin 家族的一員，β-肌動(dòng)蛋白(β-Actin，8#)是一個(gè)高度保守細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞分裂等細(xì)胞生理活動(dòng)方面發(fā)揮著重要的作用[32]。 然而，最新研究發(fā)現(xiàn)，一直被認(rèn)為是高度保守的β-Actin 的表達(dá)水平也隨著外界應(yīng)激或疾病而發(fā)生變化。 也有研究認(rèn)為，β-Actin 具有調(diào)控細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能[33]。 本研究中，可能是肺組織發(fā)育異常導(dǎo)致的病理狀態(tài)造成其中蛋白氧化損傷程度較高，使得克隆豬肺蛋白中β-Actin 發(fā)生過表達(dá)[34]。

綜上，本研究在蛋白質(zhì)水平上證實(shí)，體細(xì)胞克隆操作對(duì)成活克隆豬肺臟發(fā)育存在不可忽視的影響，體細(xì)胞克隆技術(shù)仍需進(jìn)一步優(yōu)化和完善。