湯須崇，劉希敏，盧紹基，鄧愛華，牛文靜

(1 華僑大學化工學院，福建 廈門 361021；2 廈門塔斯曼生物工程有限公司，福建 廈門 361027；3 湖南文理學院生命與環(huán)境科學學院，湖南 常德 415000)

金線蓮為蘭科花開唇蘭(Anoectochilusroxburghii(wall.)Lindl)的多年生草本藥用植物，在民間有“藥王”、“烏人參”、南方“冬蟲夏草”等美稱[1]。其味甘性平，具有清熱涼血、祛風利濕、解毒、止痛、鎮(zhèn)咳等功效[2]?，F(xiàn)代研究表明，金線蓮具有治療肝炎、支氣管炎、腎炎、膀胱炎、糖尿病、小兒急驚風等疾病[3]。金線蓮化學成分豐富，目前已經(jīng)從金線蓮分離出多糖、黃酮、揮發(fā)油、有機酸、甾體、生物堿等多種成分[4-6]。金線蓮多糖(Anoectochilusroxburghiipolysaccharide，ARP)是其主要成分之一，由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖6種單糖組成[7]。研究發(fā)現(xiàn)金線蓮的臨床藥用價值主要基于多糖的功效，如抗氧化[8]、降血糖[9-10]、抗癌[11]、提高免疫力[12]和保肝護肝[13]等方面藥理活性。因此金線蓮多糖具有很高的開發(fā)價值。

金線蓮多糖的提取方法主要有超聲波輔助提取[14]、水浸提[15]、酸堿浸提[16]、微波輔助提取[17]、超高壓輔助提取[18]和超臨界流體萃取[19]。其中超聲輔助提取方法具有節(jié)約溶劑，節(jié)能，省時，產(chǎn)率高等優(yōu)點，被廣泛用于中草藥植物的多糖提取中[20-22]，相比其他提取工藝更有利于金線蓮多糖的高效提取。本研究為了考察金線蓮中多糖提取工藝，采用超聲波輔助提取技術(shù)，運用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計以超聲溫度、超聲時間、料液比以及超聲功率的四因素三水平實驗?zāi)Ｐ?，建立回歸方程，以響應(yīng)面分析法(RSM)[23]對結(jié)果進行模擬分析，對金線蓮多糖超聲輔助提取工藝條件優(yōu)化，為進一步研究其藥理活性、作用機制及多糖產(chǎn)品開發(fā)提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

金線蓮，廈門塔斯曼生物工程有限公司；葡萄糖標準品，上海麥克林試劑有限公司；苯酚，上海麥克林試劑有限公司；硫酸，上海國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇，上海國藥集團化學試劑有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

600Y老本行多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；DHG-9075A鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；AR1502CN電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；KQ5200E超聲波清洗儀(功率300 W)，昆山市超聲儀器有限公司；UV-8000紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Hei-VAP Precision旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國海道夫公司；DK-S22電熱恒溫水浴鍋，上海精宏儀器有限公司；SHB-IIIT循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

2 方 法

2.1 金線蓮多糖的提取工藝

準確稱取5.0 g干燥至恒重的金線蓮樣品置于具塞錐形瓶中，按料液比加入一定量的水使之溶解，在一定的溫度和功率超聲處理一定時間，取出待溫度降至常溫，稱重，加水保持原來重量，過濾，收集續(xù)濾液測定其多糖含量。

2.2 多糖含量測定

2.2.1 標準曲線的繪制

精密稱取標準葡萄糖100 mg，葡萄糖提前經(jīng)105 ℃干燥至恒重，溫蒸餾水溶解并定容至100 mL，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液。精密吸取上述葡萄糖溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL至100 mL容量瓶中，蒸餾水定容。分別精密量取上述各濃度標準液2.0 mL于10 mL的具塞試管中，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻后再精密加入濃硫酸5.0 mL，搖勻；5 min后置于90 ℃的水浴鍋中加熱15 min取出，待降至常溫，于 490 nm的波長測定其吸光度。以葡萄糖濃度(ug/mL)為橫坐標，吸光值(A)為縱坐標繪制標準曲線。通過標準曲線得到方程：Y =0.0151X+0.0062，R2=0.9933。

圖1 葡萄糖濃度標準曲線

2.2.2 金線蓮多糖提取量的計算[24]

精密吸取提取液2.0 mL于10 mL的具塞試管中，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻后再精密加入濃硫酸5.0 mL，搖勻；5 min后置于90 ℃的水浴鍋中加熱15 min取出，冷卻至室溫，于 490 nm的波長測定其吸光值。

按下式計算樣品中多糖的提取量：

多糖提取量(mg/g)=C×D/m

式中，C為回歸方程計算得到的多糖含量，mg/mL；D為稀釋倍數(shù)；m為稱取金線蓮樣品的質(zhì)量，g。

2.3 單因素實驗

根據(jù)文獻報道和預(yù)實驗結(jié)果，分別考察在保證其他因素不變的情況下超聲溫度、超聲時間、料液比以及超聲功率中任一因素在選定的范圍中變化對金線蓮多糖提取量的影響。

2.3.1 超聲溫度對多糖提取量的影響

稱取干燥金線蓮樣品，根據(jù)上述金線蓮多糖的提取工藝，按料液比(g:mL)1∶40加入水，分別于溫度20、30、40、50、60、70 ℃ 進行超聲提取60 min，超聲功率設(shè)定為240 W，測定提取液中多糖含量。

2.3.2 超聲時間對多糖提取量的影響

稱取干燥金線蓮樣品，按照“2.1項金線蓮多糖的提取工藝”，按料液比(g∶mL)1∶40加入水，分別超聲提取20、40、60、80、100、120 min，超聲功率設(shè)定為240 W，溫度60 ℃，測定提取液中多糖提取量。

2.3.3 料液比對多糖提取量的影響

稱取干燥金線蓮樣品，按照“2.1項金線蓮多糖的提取工藝”，按照料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶45加水超聲提取60 min，超聲功率設(shè)定為240 W，溫度60 ℃，測定提取液中多糖提取量。

2.3.4 超聲功率對多糖提取量的影響

稱取干燥金線蓮樣品，按照“2.1項金線蓮多糖的提取工藝”，按料液比(g∶mL)=1∶40加入水，設(shè)定溫度為60 ℃，分別以超聲功率0、20%、40%、60%、80%、100%提取60 min，測定提取液中多糖提取量。

2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

按照Box-Behnken試驗設(shè)計原理，根據(jù)單因素考察實驗選取溫度(A/℃)、超聲時間(B/min)、料液比(C/g∶mL)和超聲功率(D/W)為因素，金線蓮中多糖提取率為響應(yīng)值(Y)，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗。實驗設(shè)計水平表見表1。

表1 實驗設(shè)計水平表

2.5 驗證實驗

稱取金線蓮藥材3份，按照最佳工藝條件進行提取，按照“2.1項金線蓮多糖的提取工藝”，按“2.2項多糖含量測定”測定金線蓮多糖含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實驗結(jié)果

3.1.1 溫度對多糖提取率的影響

超聲波提取溫度對金線蓮多糖提取效果的影響見圖2。由圖2可知，在20～60 ℃之間隨著溫度的升高金線蓮多糖提取率逐漸增加，當溫度升至60 ℃時，多糖提取率最高，之后到70 ℃其提取率略有下降。這可能由于多糖作為有機物質(zhì)對溫度變化十分敏感。適當?shù)臏囟瓤梢栽黾佣嗵欠肿觿幽苁蛊浼铀偃艹觯崛÷噬仙?。過高的溫度則會導(dǎo)致多糖分子結(jié)構(gòu)被破壞，喪失生物活性形成絮狀沉淀脫離體系，提取率下降[20]。因此，選擇溫度設(shè)定為60 ℃。

圖2 溫度變化對多糖提取的影響

3.1.2 超聲時間對多糖提取量的影響

實際上，智能礦井是一個復(fù)雜的巨系統(tǒng)，生產(chǎn)過程都與地理空間有關(guān)，信息化建設(shè)必須滿足監(jiān)控實時化、系統(tǒng)集成化、數(shù)據(jù)海量化、控制協(xié)同化和決策在線化的實際需求，很多事故的發(fā)生都是多專業(yè)、多因素綜合作用的結(jié)果。所以，結(jié)合空間信息技術(shù)，如何實現(xiàn)大數(shù)據(jù)技術(shù)與復(fù)雜系統(tǒng)具體業(yè)務(wù)的集成應(yīng)用，從而開發(fā)大數(shù)據(jù)集成分析平臺，使之服務(wù)于智能礦井安全生產(chǎn)、減人增效、管理升級等方面，是本文研究的重點和將要解決的問題。

超聲波提取時間對金線蓮多糖提取效果的影響見圖3。超聲時間低于60 min，多糖提取率較低；隨著時間的增加，多糖提取率有所提高，提取60 min之后，多糖提取率開始下降，這可能是由于超聲時間過長導(dǎo)致金線蓮中含有的其他物質(zhì)溶出過多搶占多糖的溶出空間，以及超聲波使得溶出的多糖結(jié)構(gòu)損壞降解[24]。從省時、節(jié)能的角度考慮，選擇超聲60 min為宜。

圖3 超聲時間變化對多糖提取的影響

3.1.3 料液比對多糖提取率的影響

超聲波提取料液比對金線蓮多糖提取效果的影響見圖4。由圖4可知，料液比(g∶mL)=1∶20～1∶40之間提取率逐漸增加，料液比較少時，多糖提取率較低，可能由于溶劑較少，細胞破壁水平低不利于多糖的溶出；料液比逐漸增加時，多糖提取率逐漸增加。料液比(g∶mL)=1∶40時，多糖提取率達到最高。之后增加料液比多糖提取率出現(xiàn)下降，可能是因為金線蓮中的其他雜質(zhì)被溶出擠占多糖的溶出空間，且金線蓮粉末具有溶脹性，提取劑增加導(dǎo)致膠質(zhì)量增大，從而降低金線蓮多糖提取量[25]。

圖4 料液比變化對多糖提取的影響

3.1.4 超聲功率對多糖提取率的影響

超聲波提取功率對金線蓮多糖提取效果的影響見圖5。由圖5可直觀看出，金線蓮多糖的提取率隨著超聲功率的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當超聲功率為80%時多糖提取率最大。超聲功率升高導(dǎo)致多糖提取率降低原因可能是超聲波提取多糖是通過空穴效應(yīng)與機械效應(yīng)使液體微粒間發(fā)生猛烈撞擊導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破碎，增加多糖的溶出，而超聲功率過高會使得多糖分子結(jié)構(gòu)被破壞，多糖被降解。綜上，超聲提取功率應(yīng)選擇80%，即是240 W。

圖5 超聲功率變化對多糖提取的影響

3.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合設(shè)計原理，采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件進行設(shè)計，實驗設(shè)計方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果

續(xù)表2

對表2中金線蓮多糖提取率(Y)及四個因素A、B、C和D的數(shù)值由Design Expert 8.0.6 軟件進行二次回歸模型擬合，回歸分析結(jié)果分別見表3。

使用Design-Expert 8.0.6軟件表3實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到的二元多項回歸方程為：

R=220.06+42.18A+5.67B+4.07C+35.53D+11.92AB-2.38AC+1.15AD+0.90BC+2.05BD+25.35CD+2.36A2+37.25B2-13.98C2+9.21D2

由表3分析結(jié)果看，其中回歸方程方差P<0.01，表明該二元多項方程模型差異顯著。而且方程的失擬項不顯著(P>0.05)，說明非試驗因素對試驗結(jié)果的影響不大，可對于金線蓮多糖提取實驗結(jié)果準確預(yù)測。回歸方程系數(shù)顯著性分析結(jié)果表明因素A，D為極顯著影響因素，CD，B2為顯著影響因素，其余因素對實驗結(jié)果影響不大。說明超聲提取溫度或超聲功率發(fā)生變化就會使金線蓮多糖提取效果顯著不同。兩兩因素之間的交互作用中，超聲功率和料液比的交互作用對金線蓮多糖提取效果影響顯著。

表3 響應(yīng)面分析法方差分析

由結(jié)果可知，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.8804，說明因變量和自變量之間線性關(guān)系顯著且擬合度較好；模型的校正決定系數(shù)Adj R2為0.7607，表明此模型能解釋76.07%響應(yīng)值的變化，即此模型與數(shù)據(jù)擬合度較高，實驗誤差影響較小。說明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化的金線蓮多糖提取工藝準確可靠。

圖6 金線蓮多糖提取響應(yīng)面分析等高線(a,c,e,h,j,l)及響應(yīng)面(b,d,f,i,k,m)

金線蓮多糖提取的等高線圖與響應(yīng)面3D圖見圖6。直觀地看交互作用的響應(yīng)面曲線圖就能發(fā)現(xiàn)各因素對響應(yīng)值的影響。在響應(yīng)面曲線圖中交互作用影響多糖提取率的顯著性與響應(yīng)面的坡度相關(guān)，曲面圖中若曲面坡度陡峭則因素發(fā)生較小變化時多糖提取率數(shù)值就會改變較大，那么兩個因素結(jié)合在一起對實驗結(jié)果影響較大。圖6(m)中，控制AB兩因素不變，CD交互作用導(dǎo)致曲面坡度陡峭即多糖提取率變化較大。

3.3 最佳提取工藝

根據(jù)分析結(jié)果，金線蓮多糖的最佳提取工藝為：提取溫度70 ℃，超聲時間60 min，料液比為1∶49.05，超聲功率為269.93 W，此條件下金線蓮多糖提取率預(yù)測值為381.07 mg/g。

3.4 最佳提取工藝驗證實驗

為確保該工藝的穩(wěn)定性與合理性，根據(jù)最佳提取工藝條件進行三組驗證實驗，按照2.1項方法制備供試品溶液，測定金線蓮多糖含量。為方便實驗具體操作，將提取溫度設(shè)定為70 ℃，超聲時間60 min，料液比為1∶49，超聲功率為270 W。實際測得金線蓮多糖平均提取量為377.4 mg/g，與理論預(yù)測值相比無顯著性差異(P<0.01)。因此，采用Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計優(yōu)化的金線蓮多糖提取工藝條件具有較高的可靠性和穩(wěn)定性。

表4 驗證實驗結(jié)果

4 結(jié) 論

本研究采用響應(yīng)面法(Design-Expert軟件)[26]考察金線蓮中多糖的提取工藝，并且做出了試驗因素間交互作用的三維立體響應(yīng)曲面和等高線圖。結(jié)果顯示，二次方程的模擬回歸差異顯著，表明模擬回歸方程能夠較高程度的擬合影響因素與提取結(jié)果之間關(guān)系，實驗設(shè)計合理。

本實驗首先通過單因素試驗分析四個因素分別對金線蓮多糖提取率的影響，選擇適當?shù)囊蛩厮?；再根?jù) Box-Benhnken 的中心組合試驗設(shè)計原理，以金線蓮多糖提取率為響應(yīng)值，溫度(A/℃)、超聲時間(B/min)、料液比(C/g:mL)和超聲功率(D/W)為影響因素設(shè)計的響應(yīng)面分析實驗。最終優(yōu)化得到的金線蓮多糖最佳提取工藝為：提取溫度70 ℃，超聲時間60 min，料液比為1∶49，超聲功率為270 W。通過驗證實驗，實際測得多糖提取率為377.4 mg/g與模型預(yù)測值381.07 mg/g相差無顯著性差異(P<0.01)，證明了該工藝的可行性。

超聲輔助提取金線蓮多糖工藝簡單易行，提取用時短；超聲波能較好地擊破中藥材的細胞壁，有利于物質(zhì)的溶出；提取過程化學試劑使用量較少，減少試劑的污染；即具有高效、省時、綠色環(huán)保等優(yōu)點。該提取工藝可為金線蓮多糖的進一步開發(fā)利用研究提供科學依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。