陳一君 唐蘭艷 韋雅淑 韋麗麗 謝丹尼

(廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧市 530021，電子郵箱：lanceiot@163.com)

地中海貧血是一種由基因缺陷引起的常染色體隱性遺傳性疾病，一般分為α型、β型、δβ型和δ型4種類型，其中α型和β型地中海貧血更為常見(jiàn)。重度α地中海貧血又稱Hb Bart′s胎兒水腫綜合征，患兒多為宮內(nèi)死亡或出生后不久死亡；而重度β地中海貧血嬰兒需長(zhǎng)期輸血維持，常因鐵負(fù)荷大而導(dǎo)致一系列并發(fā)癥[1]，兩者均給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。體外受精-胚胎移植是實(shí)現(xiàn)不孕患者生育愿望的有效途徑[2]，植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)技術(shù)于1990年首次成功應(yīng)用于臨床后，PGD在連鎖遺傳病、單基因遺傳病及染色體異常的診斷中得到越來(lái)越廣泛地應(yīng)用[3]。國(guó)內(nèi)外已對(duì)地中海貧血攜帶者開(kāi)展了PGD檢測(cè)，獲得了無(wú)相應(yīng)致病基因胎兒的成功病例[4-5]。本文對(duì)16 111例來(lái)自廣西各市縣的不孕不育患者進(jìn)行地中海貧血篩查后進(jìn)一步進(jìn)行基因診斷，從而分析其地中海貧血檢出情況及基因分布情況，為遺傳咨詢、PGD和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2018年1月至2019年12月期間來(lái)我院生殖醫(yī)學(xué)科就診并進(jìn)行地中海貧血篩查和基因診斷的16 111例不孕不育患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：在我院行地中海貧血篩查和基因診斷；因主訴不孕進(jìn)行體檢的女性，或進(jìn)入輔助生殖治療周期的夫婦雙方。排除在其他機(jī)構(gòu)行地中海貧血檢查者。其中男性5 930例、女性10 181例，年齡21～60歲，均來(lái)自廣西各市縣(見(jiàn)表1)。

表1 患者來(lái)源地區(qū)分布

1.2 方法

1.2.1 研究策略：所有患者均行血常規(guī)及血紅蛋白毛細(xì)管電泳檢測(cè)。其中平均紅細(xì)胞體積(mean corpuscular volume，MCV)<82 fL和(或)平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)<27 pg，血紅蛋白(hemoglobin,Hb)A2<2.5%，檢出血紅蛋白異常帶(如HbCS、HbH、Hb Bart等)均為篩查陽(yáng)性，篩查陽(yáng)性的患者進(jìn)行α地中海貧血基因診斷；對(duì)HbA2>3.5%和(或)HbF>2%的患者進(jìn)行β地中海貧血基因診斷。

1.2.2 血液學(xué)分析：抽取患者外周靜脈血2 mL，置入含乙二胺四乙酸二鉀的采血管內(nèi)，充分混勻后，應(yīng)用日本希森美康公司的全自動(dòng)血液分析儀Sysmex-XS-800i檢測(cè)Hb、MCV、MCH等。

1.2.3 血紅蛋白毛細(xì)管電泳：抽取患者外周靜脈血2 mL，放入含乙二胺四乙酸二鉀的采血管內(nèi)，充分混勻后，應(yīng)用法國(guó)Sebia公司Capillarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳分析儀檢測(cè)HbA、HbA2、HbF及異常血紅蛋白。

1.2.4 基因分析：(1)抽取患者外周靜脈血2 mL，放入含乙二胺四乙酸二鉀的采血管內(nèi)，充分混勻，用亞能生物科技(深圳)有限公司提供的核酸提取試劑盒(批號(hào)：WB201706001-WB201909001)提取基因組DNA，并按試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行基因分析。(2)檢測(cè)缺失型α地中海貧血基因(--SEA、-α3.7、-α4.2和--THAI)。使用深圳億立方生物技術(shù)有限公司的缺失型α-地中海貧血檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：A1710005-A1911005)，應(yīng)用GAP-PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。取樣本DNA 4 μL，反應(yīng)總體系25 μL，用T960型PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，步驟為50℃ 5 min→96℃ 5 min→(98℃ 45 s→64℃ 90 s→72℃ 180 s)×35個(gè)循環(huán)→72℃ 10 min，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳(電壓5 V/cm，60 min)，使用GelDoc XR凝膠成效系統(tǒng)(Bio-Rad公司)進(jìn)行分析，記錄結(jié)果。(2)檢測(cè)非缺失型α地中海貧血基因(αQSα、αCSα、αWSα)。使用亞能生物科技(深圳)有限公司提供的非缺失型α-地中海貧血基因突變檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：AD201709005-AD201909005)，應(yīng)用PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。取樣本DNA 2 μL，反應(yīng)總體系25 μL，用PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，步驟為50℃ 15 min→95℃ 10 min→(94℃ 60 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s)×35個(gè)循環(huán)→72℃ 5 min，取25 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交-洗膜-顯色等操作，根據(jù)膜條藍(lán)色斑點(diǎn)顯現(xiàn)位置讀取相應(yīng)位置標(biāo)注的基因型信息并記錄結(jié)果。(3)檢測(cè)β珠蛋白基因17個(gè)點(diǎn)突變。使用亞能生物科技(深圳)有限公司提供的β地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：BX201707006-BX201909006)，應(yīng)用PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。取樣本DNA 2 μL，反應(yīng)總體系25 μL，用PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，步驟為50℃ 15 min→95℃ 10 min→(94℃ 60 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s)×35個(gè)循環(huán)→72℃ 5 min，取出所有對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交-洗膜-顯色等操作，根據(jù)膜條藍(lán)色斑點(diǎn)顯現(xiàn)位置讀取相應(yīng)位置標(biāo)注的基因型信息并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用 Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，描述性分析地貧基因類型及分布。

2 結(jié) 果

在16 111例患者中，共檢出地中海貧血3 282例，總檢出率為20.37%。其中，共檢出α地中海貧血2 322例(檢出率為14.41%)， 包括22種基因型，其中檢出率最高為--SEA/αα(6.35%)，其次為- α3.7/αα(3.13%)、αCSα/αα(1.61%)和-α4.2/αα(1.31%)，見(jiàn)表2；共檢出β地中海貧血960例(檢出率為5.96%)，包括10種基因型，檢出率較高的基因型為βCD41/42/βN(2.53%)、βCD17/βN(1.69%)和β-28/βN(0.55%)，見(jiàn)表3；共檢出αβ復(fù)合型地貧144例(檢出率為0.89%)，包含26種基因型，其中以--SEA/αα復(fù)合βCD41-42/βN(19.44%)、--SEA/αα復(fù)合βCD17/βN(18.06%)及-α3.7/αα復(fù)合βCDs41-42/βN(14.58%)最為常見(jiàn)，見(jiàn)表4。

表2 α地中海貧血的檢出類型

表3 β地中海貧血的檢出類型

表4 αβ復(fù)合型地中海貧血的基因型分布情況

3 討 論

地中海貧血又稱珠蛋白生成障礙性貧血，是以珠蛋白鏈合成的減少或者缺如為特征，是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的遺傳性血紅蛋白病。重型α地中海貧血在胎兒期可出現(xiàn)胎兒水腫等表現(xiàn)，造成死胎、死產(chǎn)；β珠蛋白基因在胎兒期基本不表達(dá)，其異常引起的重度β地中海貧血在患兒出生后會(huì)逐漸出現(xiàn)嚴(yán)重貧血等臨床癥狀，進(jìn)行性貧血將在3～6個(gè)月內(nèi)逐漸出現(xiàn)，需要長(zhǎng)期輸血、除鐵治療或造血干細(xì)胞移植，均給個(gè)人、家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)[6]。血液學(xué)資料分析是篩查地中海貧血的可靠指標(biāo)，MCV、MCH和血紅蛋白電泳可作為地中海貧血不同基因型臨床鑒別診斷的參考[7]。隨著基因檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測(cè)的成本相對(duì)降低，檢測(cè)設(shè)備也相對(duì)普及，基因分型的覆蓋面也越來(lái)越廣，基因檢測(cè)已成為地中海貧血診斷的金標(biāo)準(zhǔn)；血紅蛋白電泳，特別是高效、蛋白區(qū)帶分化清晰的毛細(xì)管電泳，也成為異常血紅蛋白檢測(cè)的必要手段[8]。鑒于廣西地區(qū)地中海貧血發(fā)生率居高不下的現(xiàn)狀，有學(xué)者提議此兩項(xiàng)檢查應(yīng)在廣西不孕不育人群就診中作為常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，有條件的機(jī)構(gòu)還可對(duì)異常病例進(jìn)行高通量測(cè)序[9]，可進(jìn)一步減少地貧及相關(guān)突變基因的漏檢率。

既往調(diào)查顯示，廣西α地中海貧血、β地中海貧血基因的人群攜帶率分別為 14.95%、6.78%[10]； 劉富華等[11]對(duì)2012～2014年就診的13 589例廣西居民進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，地中海貧血總檢出率為21.09%，其中α地中海貧血、β地中海貧血的檢出率分別為12.93%、8.16%。在本研究納入的16 111例不孕不育患者中，地中海貧血總檢出率為20.37%，其中α地中海貧血檢出率為14.41%，β地中海貧血檢出率為5.96%，αβ復(fù)合型地中海貧血基因檢出率為0.89% ，與上述針對(duì)廣西人群的研究結(jié)果相似，提示來(lái)自本地區(qū)的不孕不育人群與非特定人群的地中海貧血檢出率大致符合，但是否表明地中海貧血攜帶與不孕不育的發(fā)生無(wú)相關(guān)關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。

在針對(duì)各地區(qū)不孕不育患者的研究中，潘子湘等[12]在來(lái)自桂林地區(qū)的不孕不育人群中檢出α地中海貧血和β地中海貧血基因總攜帶率為14.24%，其中α地中海貧血、β地中海貧血、αβ復(fù)合型地中海貧血的檢出率分別為10.32%、3.42%、0.50%；王麗娟等[13]對(duì)來(lái)自深圳市的不孕不育患者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示α地中海貧血和β地中海貧血基因總攜帶率為9.01%，α地中海貧血、β地中海貧血、αβ復(fù)合型地中海貧血分別為6.58%、2.69%、0.27%；姜柯安等[14]對(duì)來(lái)自四川省及周邊地區(qū)不孕不育的患者調(diào)查中，檢出α地中海貧血、β地中海貧血基因的攜帶率分別為2.03%、1.16%，總檢出率為3.26%。本研究納入了來(lái)自廣西各市縣的不孕不育患者進(jìn)行分析，其地中海貧血檢出率高于上述不同省份地區(qū)人群的檢出率，也相對(duì)高于同在廣西的桂林地區(qū)不孕不育人群，說(shuō)明不孕不育人群中地中海貧血基因攜帶率有明顯地域性差異。

本研究共檢測(cè)出地貧基因型48種，其中常見(jiàn)的α地貧基因型為--SEA/αα，其次為-α3.7/αα、αCSα/αα和-α4.2/αα，常見(jiàn)的β地貧基因型為βCD41/42/βN、βCD17/βN和β-28/βN，各基因型構(gòu)成比與王文杰等[15]針對(duì)廣西人群的統(tǒng)計(jì)結(jié)果相似。而莫亞虹等[16]對(duì)來(lái)自海南地區(qū)的育齡夫婦的檢測(cè)結(jié)果顯示，最常見(jiàn)的α地貧基因型為-α3.7/αα，其次為-α4.2/αα及--SEA/αα；藍(lán)惠華等[17]檢出安徽及周邊地區(qū)人群最常見(jiàn)的3種β地中海貧血基因類型依次為IVS-Ⅱ-654、CD41-42、CD17；姚莉琴等[18]在云南婚檢人群中發(fā)現(xiàn)，主要的β地中海貧血基因型為βE、βCD17、βCD41-42。來(lái)自各不同地區(qū)的人群地中海貧血檢出率、構(gòu)成比或基因型分布有著較大差異，說(shuō)明地中海貧血基因分布有明顯地域差異與種族特征。

泰國(guó)缺失型地中海貧血(--THAI)于20世紀(jì)80年代首次被發(fā)現(xiàn)[19]，在泰國(guó)等東南亞國(guó)家多發(fā)，我國(guó)廣東汕頭、廣西、香港、臺(tái)灣等地亦有病例報(bào)道。其缺失約34Kb的α珠蛋白基因簇，累及α珠蛋白基因及ζ珠蛋白基因，--THAI突變純合子由于不能合成胚胎期血紅蛋白，故在妊娠早期不能存活[20]。在本研究中，共檢出--THAI/αα攜帶者14例，占0.09%，略低于黎永鑒等[21]報(bào)告的梧州地區(qū)檢出率(0.28%)；此外檢出--THAI/αα復(fù)合βCD41/42/βN 2例，復(fù)合βCD26/βN 1例。國(guó)內(nèi)大多數(shù)α地中海貧血基因診斷試劑盒主要針對(duì)3種常見(jiàn)的缺失類型(- -SEA、-α3.7、-α4.2)及突變類型(αQSα、αCSα、αWSα)，而泰國(guó)缺失型(--THAI)在廣西人群中有一定發(fā)生率，且其中重癥患者臨床癥狀嚴(yán)重[22]，因此應(yīng)加入常規(guī)α地貧基因檢測(cè)類型中。

對(duì)地中海貧血高危夫婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷和選擇性終止妊娠，是目前對(duì)于重癥地中海貧血的有效預(yù)防措施。但相比于承受產(chǎn)前診斷與流產(chǎn)手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)，在以試管嬰兒技術(shù)嘗試妊娠的地貧基因攜帶者夫婦中進(jìn)行PGD可能是更好的選擇。第三代體外嬰兒也稱為PGD，對(duì)于一些已知遺傳病的夫婦，在體外受精技術(shù)的基礎(chǔ)上，從卵子、胚胎或囊胚中提取一些物質(zhì)進(jìn)行遺傳檢測(cè)，選擇沒(méi)有相應(yīng)致病基因的胚胎進(jìn)行移植[23]。對(duì)于同一類型的地中海貧血患者，在體外受精過(guò)程中采用PGD技術(shù)選擇正常胚胎移植，可極大程度上避免中重度地中海貧血患兒的出生。在PGD的過(guò)程中，同時(shí)進(jìn)行地貧與人類白細(xì)胞抗原的配型試驗(yàn)，選擇與同胞兒童相同配型的非重度地貧胚胎移植，既避免了相應(yīng)的地貧出生缺陷，可使用臍血和骨髓干細(xì)胞移植，治療重癥地中海貧血患兒[24]。

本研究的不孕不育人群地中海貧血檢出率與本地區(qū)非特定人群相似，常見(jiàn)的α地貧基因型為--SEA/αα，其次為-α3.7/αα、αCSα/αα和-α4.2/αα，常見(jiàn)的β地貧基因型為βCD41/42/βN、βCD17/βN和β-28/βN，但不孕不育人群地中海貧血檢出率和基因型分布或存在地域差異與種族特征。本研究的結(jié)果或可為進(jìn)一步開(kāi)展第三代試管嬰兒技術(shù)提供分子基礎(chǔ)和依據(jù)。本研究的樣本量雖然較大，患者來(lái)源地區(qū)分布廣西14個(gè)地級(jí)市，但多集中于南寧市和百色市，未能進(jìn)行隨機(jī)抽樣納入研究對(duì)象，人群的代表性可能不足?？傊_(kāi)展基因診斷和血紅蛋白檢測(cè)，對(duì)地貧高危夫婦進(jìn)行遺傳指導(dǎo)，必要時(shí)進(jìn)行PGD檢測(cè)，將有效避免重癥地貧兒的出生，降低出生缺陷，提高人口質(zhì)量。