廖健明 秦祖杰 楊秋雨 黎仁權(quán) 許圍城

(1 廣西中醫(yī)藥大學研究生學院，南寧市 530000，電子郵箱:1634935973@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧市 530200)

肝細胞癌是原發(fā)性肝癌中最常見的類型，其發(fā)病率及死亡率高，嚴重威脅我國人民健康[1]。大多數(shù)肝細胞癌患者確診時已處于疾病晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此手術(shù)切除、血管介入、射頻消融術(shù)及肝移植等治療未能達到根除治療的目的；同時傳統(tǒng)化療治療肝細胞癌效果差，而分子靶向藥物的治療范圍也較局限[2]，因此效果也相當有限。

壯醫(yī)藥具有明顯的地區(qū)特色及民族特色，對于治療壯族聚居地區(qū)常見病、多發(fā)病具有獨到見解[3]。廣西為我國藥材資源極其豐富的地區(qū)，其中許多藥物在預防和治療腫瘤方面具有一定療效[4]。肝癌，壯醫(yī)未有明確病名，按照其臨床表現(xiàn)，可納入為黃標(黃疸)及水蠱(蠱病)范疇，認為其乃因正氣虛弱，不能抗邪，導致毒邪內(nèi)侵，使三氣不能同步、三道兩路不通而為病，其中多以龍路不通為主要表現(xiàn)，故易出現(xiàn)瘀血內(nèi)患。壯藥雞血藤為豆科植物蜜花豆的干燥藤莖，性苦、甘，歸肝、腎經(jīng)，壯醫(yī)認為其具有補血活血、通調(diào)龍路火路的功效[5]，可使瘀堵之龍路通暢，從而達到治療肝癌的目的。雞血藤中含有許多成分，現(xiàn)代研究表明，雞血藤中的化合物主要有甾醇類、黃酮類、蒽醌類、萜類、苷類、內(nèi)酯類等，具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血液系統(tǒng)、抗病毒、保肝等作用[6]。研究顯示，補益氣血及理氣活血藥在治療肝細胞癌中具有極其重要的作用[7]，而雞血藤具有活血補血之功，為臨床上治療肝癌的常用藥，但其具體作用機制不明，同時雞血藤含有較多化合物，因此研究雞血藤作用機制具有一定的難度。

網(wǎng)絡藥理學通過分析疾病網(wǎng)絡庫、藥物網(wǎng)絡庫、基因網(wǎng)絡庫、蛋白網(wǎng)絡庫等數(shù)據(jù)庫中的信息，利用電腦軟件及算法揭示疾病-藥物-靶點-基因之間的關(guān)聯(lián)，分析復雜藥物作用于人體的機制[8]。故本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法，分析雞血藤的有效成分、作用靶標以及肝細胞癌的疾病相關(guān)靶標，構(gòu)建中藥-成分-疾病-靶標圖形，并對篩選出的靶標進行基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，從而探討雞血藤治療肝細胞癌的作用機制。

1 資料與方法

1.1 雞血藤有效成分篩選及靶標預測 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php，版本2.3)，按照口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%、類藥性(drug-likeness,DL)>0.18，初步篩選雞血藤的有效成分。然后采用Perl軟件(https://www.perl.org/get.html，版本10.0.0)對篩選出的相關(guān)有效成分的作用靶標進行預測。

1.2 添加雞血藤作用靶標的基因名 利用Perl軟件和UniProt知識庫(https://www.uniprot.org)為篩選出的靶標添加基因名(gene symbol)，并將UniProt知識庫中找不到相關(guān)基因名的靶標刪除。

1.3 獲取肝細胞癌相關(guān)疾病靶標 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/，版本4.12)、OMIM數(shù)據(jù)庫中(https://www.omim.org)，以“hepatocellular carcinoma”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)靶標，得到肝細胞癌的疾病相關(guān)靶標。

1.4 構(gòu)建中藥-疾病靶標 利用R語言軟件(https://www.r-project.org/，版本3.6.1)，對雞血藤作用靶標與肝細胞癌的疾病相關(guān)靶標取交集，得到中藥-疾病共同靶標，并繪制Venn圖。

1.5 構(gòu)建中藥-成分-疾病-靶標調(diào)控網(wǎng)絡 利用Perl軟件將1.2獲得的靶標基因名與1.4獲得的中藥-疾病共同靶標進行映射，然后利用Cytoscape軟件(https://cytoscape.org/，版本3.6.1)進行可視化分析，得到中藥-成分-疾病-靶標調(diào)控網(wǎng)絡。

1.6 中藥-疾病靶標蛋白相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建與核心基因的篩選 在STRING在線軟件(https://string-db.org/，版本11.0)中輸入中藥-疾病共同靶標，并以選擇人為種屬、0.4為最小互作分數(shù)作為篩選條件軟件，得到并保存制作蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡所需的文件，再將所得文件利用R語言進行計算，最終得到PPI及其核心基因條形圖。

1.7 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 將中藥-疾病共同靶標輸入R語言軟件并計算，并以P<0.05為統(tǒng)計學差異，得到GO功能富集分析圖和KEGG通路富集分析圖。

2 結(jié) 果

2.1 雞血藤的有效成分及其靶標 根據(jù)OB及DL對所有已報告的雞血藤有效成分及相關(guān)靶標進行篩選，共搜索到有效成分24個(見表1)，相關(guān)靶標1 142個。

表1 雞血藤的有效成分篩選結(jié)果

2.2 中藥-疾病的共同靶標構(gòu)建結(jié)果 將篩選出的1 142個雞血藤作用靶標與6 713個肝細胞癌疾病靶標輸入R語言軟件并取交集，得到中藥-疾病共同靶標的Venn圖(見圖1)，同時得到46個中藥-疾病的共同靶標。

圖1 中藥-疾病靶標Venn圖

2.3 中藥-成分-疾病-靶標調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建結(jié)果 中藥-成分-疾病-靶標調(diào)控網(wǎng)絡見圖2，提示壯藥雞血藤主要通過22種有效成分作用于46個共同靶標。

圖2 中藥-成分-疾病-靶標調(diào)控網(wǎng)絡

2.4 PPI網(wǎng)絡及核心靶標 相鄰接的節(jié)點數(shù)目越多，作為核心基因的可能性越大，因此雞血藤-肝細胞癌靶標PPI網(wǎng)絡的核心基因按鄰接節(jié)點數(shù)目由多到少排序依次為：表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、MYC、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific protease,Caspase)3、細胞周期蛋白D1(cyclinD1)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、酪氨酸激酶受體2(receptor tyrosine kinase 2,ERBB2)、雌激素受體(estrogen receptor,ESR)1、鼠雙微粒體2(murine double minute 2,MDM2)、Caspase8、骨髓細胞因子1(myeloid cell leukemia 1,MCL1)、RELA、雄激素受體(androgen receptor,AR)、Caspase9、細胞周期蛋白B1(cyclinB1)、過氧化物酶體增生激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)、細胞周期檢控點激酶1(cell cycle checkpoint kinase 1,CHEK1)、視網(wǎng)膜母細胞瘤1(retinoblastoma 1,RB1)、糖原合酶激酶3Β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3B)、含桿狀病毒IAP重復序列蛋白5(baculoviral IAP repeat-containing protein 5,BIRC5)、Caspase7、淀粉樣β前體蛋白(amyloid beta precursor protein,APP)、核因子κB抑制因子α(nuclear factor kappaB inhibitor alpha,NFKBIA)、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)、ESR2、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、蛋白激酶Cα(protein kinase C alpha,PRKCA)、核受體輔助活化子1(nuclear receptor coactivator 1,NCOA1)、尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,PLAU)、B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,BCL2)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Pi1(glutathione S-transferase Pi 1,GSTP1)、溶質(zhì)載體家族2成員4(solute carrier family 2 member 4,SLC2A4)、腫瘤蛋白p63(tumor protein p63,TP63)、對氧磷酶1(paraoxonase 1,PON1)、醛縮酮還原酶家族1成員B1(aldo-keto reductase family 1 member B1,AKR1B1)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,ACHE)、NUF2。見圖3～4。

圖3 中藥-疾病共同靶標的PPI網(wǎng)絡

圖4 中藥-疾病核心靶標條圖

2.5 GO功能富集分析結(jié)果 核心基因的GO功能主要有半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與的凋亡過程、類固醇激素受體活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、核激素受體結(jié)合等。見圖5。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果 癌核心基因的主要涉及通路：前列腺癌信息通路、人巨細胞病毒感染信號通路、乙型病毒性肝炎信號通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路、EB病毒感染信號通路、膀胱癌信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體信號通路、p53信號通路、鉑耐藥信號通路、乳腺癌信號通路、癌癥中的微小RNA信號通路、丙型病毒性肝炎信號通路、甲狀腺激素信號通路等。見圖6。

圖6 KEGG通路富集分析柱狀圖

3 討 論

壯醫(yī)稱肝臟為“咪疊”，認為其是血液貯藏的主要器官，具有調(diào)節(jié)血液流量的功能[9]。血液運行的道路為“龍路”，故肝為龍路聚集之地。酒食不節(jié)、毒邪外侵、情志內(nèi)傷等多種因素導致機體損傷，龍路不通，而致肝臟損害，因龍路不暢而導致水濕氣血積于腹內(nèi)，易引起腹部脹大、腹水[10]，故壯醫(yī)多將肝細胞癌列入“水蠱”的范疇。同時，壯醫(yī)認為疾病的發(fā)生是因為人體氣血分布的不均衡，臨床上可出現(xiàn)氣血偏衰、氣血偏亢及氣血瘀滯，在治療時便使用調(diào)氣、解毒、補虛、祛瘀四個原則來達到調(diào)整人體氣血的目的[11]，從而使疾病恢復?！八M”在發(fā)病過程中，兼有氣血偏衰及氣血瘀滯兩者，故在治療時應使用補血通龍路的藥物，而雞血藤為常用的補血通龍路的藥物。

本研究結(jié)果顯示，雞血藤主要通過22種有效成分作用于46個靶標，影響肝細胞癌相關(guān)的基因、酶及因子，達到治療肝細胞癌的目的。進一步分析發(fā)現(xiàn)，雞血藤-肝細胞癌靶標PPI網(wǎng)絡的核心基因有EGFR、MYC、Caspase3、cyclinD1、IL-6、VEGFA、ERBB2、ESR1、MDM2、Caspase8等，而這些基因可影響胰島素樣生長因子-1受體活性、抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子活性、磷脂酰肌醇3激酶活性、蛋白激酶B活性、黏著斑激酶活性、酪氨酸激酶2活性、cAMP反應元件結(jié)合蛋白/激活轉(zhuǎn)錄因子-2/激活蛋白-2活性、端粒酶活性、細胞因子B1活性、周期蛋白依賴性激酶1活性、絲裂酶原激活蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)化生長因子β活性[12-14]，因此推測雞血藤通過調(diào)控以上基因，影響相關(guān)因子及酶的活性，從而達到治療肝細胞癌的目的。

雞血藤治療肝細胞癌的核心基因涉及的KEGG通路眾多，這些通路主要包括前列腺癌信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路、乙型病毒性肝炎信號通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路、EB病毒感染信號通路、膀胱癌信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體信號通路、p53信號通路、鉑耐藥信號通路、乳腺癌信號通路、癌癥中的微小RNA信號通路、丙型病毒性肝炎信號通路、甲狀腺激素信號通路等。其中乙型病毒性肝炎在肝細胞癌的發(fā)病過程中具有極其重要的作用；有研究表明，乙型肝炎病毒在肝細胞癌的轉(zhuǎn)化過程中起到直接作用，乙肝病毒基因組可整合到宿主DNA中，且乙肝病毒X蛋白可影響宿主信號傳導通路的調(diào)控和核轉(zhuǎn)錄因子的啟動子水平，同時還可影響宿主T細胞免疫應答、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、免疫逃逸等作用[15]。此外，丙型病毒性肝炎起病隱匿，慢性感染者中有極高比例可發(fā)展為肝細胞癌，可能由丙肝病毒引起的氧化應激所致[16]；2型糖尿病是肝細胞癌的獨立危險因素，胰島素抵抗及2型糖尿病可引發(fā)胰島素抵抗、脂肪代謝紊亂、炎癥因子異常等，導致正常肝細胞凋亡，增加肝纖維化風險，從而導致肝細胞癌的發(fā)生[17]；人巨細胞病毒感染為人類感染率極高的一類病毒，可對嬰幼兒肝臟造成損傷，先天性感染者尤甚[18]；卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒的傳播途徑與多種腫瘤的發(fā)病相關(guān)，其中包括肝細胞癌，這可能與該病毒與經(jīng)血液傳播的肝炎病毒的傳染途徑相似，影響乙肝病毒的復制相關(guān)，同時該病毒與鼻咽癌、原發(fā)性滲出性淋巴瘤等相關(guān)[19-20]；EB病毒為多種疾病的致病因素，如EB病毒性肝炎、鼻咽癌、伯基特淋巴瘤等，EB病毒性肝炎可導致嚴重的肝功能損害，而存在肝臟功能損害時又可誘導EB病毒從潛伏狀態(tài)變成激活狀態(tài)，從而加重肝功能損害[21]。

綜上所述，雞血藤治療肝細胞癌的作用機制為雞血藤中眾多有效成分調(diào)控肝細胞癌的相關(guān)基因，從而影響多種信號通路，最終在多種信號通路的綜合作用下，人體表現(xiàn)出相應的表型。需要注意的是，此表型除了受到中藥影響外，還可受體內(nèi)環(huán)境、體外環(huán)境及基礎(chǔ)疾病的影響，因此在使用藥物治療時，應重視體內(nèi)環(huán)境、體外環(huán)境及基礎(chǔ)疾病的情況，注意因人而異、因時而異、因病而異，按照傳統(tǒng)醫(yī)學辨證辨病思維用藥，達到使藥物作用最大化的目的。