陳 怡，劉石泉，李滔滔，余松林，汪無忌，胡治遠(yuǎn)

(湖南城市學(xué)院 黑茶金花湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 益陽413000)

冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是散囊菌屬的一種真菌，作為茯磚茶發(fā)花過程中的優(yōu)勢微生物而被人們所熟知，其在茶葉中生長，可代謝轉(zhuǎn)化茶葉中的化學(xué)成分，并生成一系列生理活性物質(zhì)，有改良茶葉品質(zhì)和提升保健功效的作用[1]﹒利用冠突散囊菌加工的黑茶或其他發(fā)酵產(chǎn)品，在減肥[2]、降脂[3]、抗氧化[4]和調(diào)節(jié)人體免疫[5]等方面的生理活性作用尤為顯著﹒近年來，冠突散囊菌已成為微生物資源領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，對其生理特性、發(fā)酵工藝和分類鑒定等方面的研究較多﹒在人工培養(yǎng)或自然條件下，冠突散囊菌主要通過有性結(jié)構(gòu)子囊孢子進(jìn)行繁殖[6]，而無性型孢子—分生孢子則鮮少出現(xiàn)；并且其分生孢子呈較淺的灰綠色[7]，常規(guī)培養(yǎng)基上不易被觀察到，這限制了對冠突散囊菌的全面了解﹒參考鄭欣欣[8]和呂嘉櫪等[9]的研究結(jié)果可知，高滲培養(yǎng)基和高溫環(huán)境等可促使冠突散囊菌生殖方式由有性型向無性型轉(zhuǎn)變﹒但對于冠突散囊菌無性孢子的具體產(chǎn)孢條件及其發(fā)酵工藝優(yōu)化方面的研究則尚未見于報(bào)道，這不利于對冠突散囊菌這一重要微生物資源的進(jìn)一步認(rèn)識與利用﹒鑒于此，本文通過探索不同培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)冠突散囊菌分生孢子的最佳產(chǎn)孢工藝，以期為研究冠突散囊菌兩性發(fā)育和產(chǎn)孢機(jī)制等提供試驗(yàn)基礎(chǔ)﹒

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

冠突散囊菌(JH1205)由黑茶金花湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供﹒

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種活化與培養(yǎng)采用改良PDA 培養(yǎng)基，制備方法如下：200 g 馬鈴薯切片，加水煮沸后持續(xù)30min，過濾去除馬鈴薯渣，添加100 g 蔗糖、5 g NaCl 和20 g 瓊脂粉并攪拌溶解，補(bǔ)充蒸餾水定容至1 000m L﹒

1.2 儀器設(shè)備與試劑

YP802N 型電子分析天平(上海精科儀器設(shè)備公司)；VD-650單人型超凈工作臺(迎工機(jī)械有限公司)；DHP-9810型生化培養(yǎng)箱(上海一恒儀器有限公司)；JSM-6380LV 型掃描電子顯微鏡(日本日立電子株式會社)；CFIS60型倒置顯微鏡(江南永新儀器有限公司)；HY-4A 型振蕩器(湖南力辰儀器科技有限公司)；XFH-70C型自動蒸汽滅菌鍋(浙江新豐儀器有限公司)﹒試驗(yàn)所用NaCl、瓊脂粉和蔗糖等試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純﹒

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冠突散囊菌孢子懸液的制備

取菌落長勢良好的PDA 平板，注入無菌水并用菌種刮鏟刮取菌落上的孢子，將菌液適度稀釋并振搖均勻后，獲得冠突散囊菌孢子懸液(經(jīng)血球計(jì)數(shù)板法檢測孢子數(shù)量為106個/mL)，以此作為接種液﹒

1.3.2 不同濃度蔗糖誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)

制備PDL 液體培養(yǎng)基：每1 000 mL 培養(yǎng)基使用300 g 馬鈴薯，設(shè)置NaCl含量為10%，分裝后添加不同質(zhì)量的蔗糖，分別配制出蔗糖含量為5%，10%，15%，20%，25%和30%的6組PDL培養(yǎng)液；高壓蒸汽滅菌后，在超凈工作臺上將培養(yǎng)液按每瓶100mL 分裝至400mL 植物組織培養(yǎng)瓶，每個蔗糖濃度梯度設(shè)置3組平行；最后用移液槍接種1 mL 冠突散囊菌孢子懸液，輕微搖勻后置于28℃恒溫箱靜置培養(yǎng)﹒

1.3.3 不同濃度NaCl 誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)

液體培養(yǎng)基的制備同1.3.2，設(shè)置NaCl梯度為4%，6%，8%，10%，12%和14%，每組樣品設(shè)置3個平行，按1.3.2 的方法接種孢子懸液并置于28℃環(huán)境培養(yǎng)﹒

1.3.4 不同溫度誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)

液體培養(yǎng)基的制備同1.3.2，設(shè)置蔗糖濃度為10%、NaCl濃度為10%，按1.3.2 的方法接種孢子懸液，分別置于28，30，32，34，36和38℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每個試驗(yàn)組設(shè)置3個平行﹒

1.3.5 冠突散囊菌兩性孢子的觀察與區(qū)分

挑取生長狀況適宜的菌體制成固定標(biāo)本，采用離子濺射儀對樣品表層進(jìn)行噴金處理后[10]，在掃描電鏡下觀察其有性形態(tài)及無性形態(tài)；配合電鏡觀察的結(jié)果，在倒置顯微鏡下觀察并進(jìn)一步確認(rèn)兩性形態(tài)的結(jié)構(gòu)差異；綜合菌落表面形態(tài)、倒置顯微鏡及電子顯微鏡觀察的結(jié)果，確認(rèn)冠突散囊菌無性生殖形態(tài)的特征﹒

1.3.6 冠突散囊菌分生孢子的計(jì)數(shù)

挑取一瓶培養(yǎng)瓶內(nèi)的全部菌體，置于100m L搖瓶內(nèi)，加入少量無菌生理鹽水和玻璃珠，置于振蕩器上300 r/min 振搖打散菌體；過200 目篩以獲得含有孢子的濾液，用無菌生理鹽水重復(fù)洗滌、過濾6次以充分洗脫附著在菌體上的孢子；合并孢子濾液定容至1 000m L并再次混勻，采用血球計(jì)數(shù)板法[11]在倒置顯微鏡下統(tǒng)計(jì)冠突散囊菌分生孢子的數(shù)量，計(jì)算出每毫升培養(yǎng)液通過發(fā)酵后獲取的冠突散囊菌分生孢子數(shù)量(個/mL)﹒

1.3.7 冠突散囊菌產(chǎn)分生孢子的正交優(yōu)化試驗(yàn)

依據(jù)1.3.2 ～1.3.4 單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定不同的蔗糖濃度、NaCl濃度和發(fā)酵溫度3個因素的具體參數(shù)，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化冠突散囊菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)分生孢子的工藝，每組發(fā)酵條件設(shè)置3組平行，結(jié)果取平均值，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)如表1所示﹒

表1 正交試驗(yàn)的因素與水平

獲取最佳條件工藝后，在此培養(yǎng)條件下開展驗(yàn)證試驗(yàn)，接種及培養(yǎng)方法同1.3.2，平行培養(yǎng)5組，通過相對標(biāo)準(zhǔn)偏差評估試驗(yàn)結(jié)果的精密度﹒1.3.8 菌株JH1205產(chǎn)分生孢子的培養(yǎng)時間優(yōu)化

根據(jù)1.3.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行液體培養(yǎng)，并于培養(yǎng)的第4，5，6和7 d 觀察并檢測培養(yǎng)液中分生孢子含量，確定優(yōu)化發(fā)酵工藝下冠突散囊菌分生孢子最佳產(chǎn)孢時間﹒

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌的兩性型形態(tài)差異

冠突散囊菌的兩性型差異如圖1所示﹒

圖1 冠突散囊菌的兩性型差異

由圖1不難發(fā)現(xiàn)，其有性型與無性型的差異較為顯著：有性型菌膜呈現(xiàn)金黃色，菌膜表面粗糙而致密，菌膜中央部位偶爾可見黑褐色香油狀滲出液，隨生長時間的延長，菌膜顏色逐漸變深成為棕黃色，且滲出液增多，到后期則完全轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚?；無性型菌膜緊致而細(xì)密，表面相對有性型較為光滑，無滲出液，菌膜色澤呈較均勻的灰綠色，和有性型區(qū)分度較高(見圖1A)﹒在電鏡觀察下，未成熟的閉囊殼為橢球狀(見圖1B)，外表纏繞有大量營養(yǎng)菌絲，直徑100～150μm；子囊孢子表面粗糙具尖疣(見圖1C)，赤道部位具有顯著的冠狀突起，大小4～5μm×5～6μm；光鏡觀察下，子囊孢子與電鏡形態(tài)基本一致，可通過其雙凸鏡的造型與分生孢子區(qū)分開來(見圖1D)﹒電鏡觀察下，分生孢子頭由菌絲特異化形成，形似掃帚狀，孢子梗上串生有大量分生孢子(見圖1E)，隨時間延長而逐漸增大；成熟的分生孢子從孢梗莖上脫落(見圖1F)，孢子呈橢球狀，外壁布滿小點(diǎn)狀突起，直徑4～5μm，其形狀相對子囊孢子較為規(guī)則﹒冠突散囊菌兩性型的形態(tài)差異與譚玉梅等[12]的研究結(jié)果基本一致，電鏡下偶爾可觀察到有性型和無性型分布在一個視野內(nèi)(見圖1H)，可通過表觀形態(tài)和顯微特征等將其有性型與無性型有效區(qū)分開來﹒

2.2 不同濃度蔗糖對冠突散囊菌分生孢子產(chǎn)量的影響

當(dāng)發(fā)酵液NaCl 含量為10%、培養(yǎng)溫度28℃和培養(yǎng)時間5 d 時，不同濃度蔗糖對冠突散囊菌分生孢子的生長影響如圖2所示﹒

圖2 不同濃度蔗糖對冠突散囊菌分生孢子產(chǎn)量的影響

在圖2中，當(dāng)蔗糖含量在5%～15%之間時，隨蔗糖濃度的上升，分生孢子產(chǎn)量也隨之快速提高；當(dāng)蔗糖含量在15%～25%之間時，孢子產(chǎn)量仍然與蔗糖濃度正相關(guān)，但提升速度開始減緩；當(dāng)蔗糖含量為25%時，孢子產(chǎn)率達(dá)到最高值4.13×107個/mL，比蔗糖含量5%時提高了接近3倍﹒這說明，蔗糖作為冠突散囊菌適宜利用的碳源[9]，一方面可以促進(jìn)發(fā)酵液中的菌體生長，有效提高總生物量；另一方面，高濃度蔗糖使得培養(yǎng)液滲透壓上升，也可以促使其繁殖方式由有性型向無性型轉(zhuǎn)變，提高分生孢子的產(chǎn)率﹒但蔗糖含量進(jìn)一步提高至30%時，孢子產(chǎn)率反而有所下降，有可能是蔗糖導(dǎo)致培養(yǎng)液滲透壓過高，反過來抑制了菌體的生長；亦有可能是過高濃度的蔗糖使培養(yǎng)液變得粘稠，導(dǎo)致底物流動性下降，不利于菌體的發(fā)育﹒因此，單因素試驗(yàn)最適宜的蔗糖添加量選定為25%﹒

2.3 不同濃度NaCl對冠突散囊菌分生孢子產(chǎn)量的影響

當(dāng)發(fā)酵液蔗糖含量為10%，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為5 d 時，不同濃度NaCl對冠突散囊菌分生孢子的生長影響如圖3所示﹒

圖3 不同濃度NaCl 對冠突散囊菌分生孢子產(chǎn)量的影響

由圖3可知，在NaCl 濃度較低(＜8%)時，冠突散囊菌繁殖方式以有性的子囊孢子為主，隨著NaCl 濃度的增加，發(fā)酵液中灰綠色分生孢子的比例逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵液NaCl 濃度≥8%后，無性繁殖則開始占據(jù)主導(dǎo)，尤其是在NaCl 濃度≥10%的發(fā)酵液中，基本未見金黃色閉囊殼結(jié)構(gòu)﹒NaCl濃度為10%時分生孢子產(chǎn)量達(dá)到最高值2.28×107個/mL，說明適當(dāng)濃度的NaCl 可以通過改變細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓和影響代謝方式來改變菌株的生殖模式[13]﹒而當(dāng)NaCl 的濃度再進(jìn)一步提升時，分生孢子產(chǎn)量顯著下降，由發(fā)酵液中較低的菌體生物量可以推測，高濃度的NaCl 對冠突散囊菌營養(yǎng)菌絲的生長有一定抑制作用，從而導(dǎo)致了產(chǎn)孢量的減少﹒

2.4 不同發(fā)酵溫度對冠突散囊菌分生孢子產(chǎn)量的影響

當(dāng)發(fā)酵液NaCl含量為10%、蔗糖含量10%和培養(yǎng)時間5 d 時，不同培養(yǎng)溫度對冠突散囊菌分生孢子的生長影響如圖4所示﹒

圖4 不同發(fā)酵溫度對冠突散囊菌分生孢子產(chǎn)量的影響

由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度處于28～34℃時，隨著溫度的升高，冠突散囊菌分生孢子的產(chǎn)量隨之上升，在34℃時孢子產(chǎn)量達(dá)到最大值3.08×107個/mL﹒這說明在同樣的培養(yǎng)基條件下，不同的生長溫度會影響冠突散囊菌基因的表達(dá)，使得其繁殖模式發(fā)生轉(zhuǎn)變，從而大量產(chǎn)生抗逆性較強(qiáng)的分生孢子，這一點(diǎn)和其它真菌在不同環(huán)境條件下的兩性繁殖模式是類似的[14]﹒當(dāng)溫度高于34℃時，隨著溫度的升高，分生孢子的產(chǎn)量卻開始下降，其主要原因可能是冠突散囊菌作為一種真菌，其菌絲最適宜的生長溫度為28℃左右[15]，故對高溫的耐受能力相對較差，而在菌絲生物量較低的情況下，會影響分生孢子的產(chǎn)生﹒

2.5 冠突散囊菌產(chǎn)分生孢子的正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，開展不同的蔗糖濃度、NaCl 濃度和發(fā)酵溫度的3因素3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示﹒

表2 不同培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，不同因素對分生孢子產(chǎn)率的影響的大小依次為：NaCl濃度＞發(fā)酵溫度＞糖濃度，優(yōu)化后的最佳產(chǎn)孢條件為A1B2C2，即蔗糖含量20%、NaCl含量10%和培養(yǎng)溫度34℃，此條件下培養(yǎng)獲得的孢子產(chǎn)量為6.91×107個/mL﹒

2.6 優(yōu)化產(chǎn)孢條件驗(yàn)證試驗(yàn)

制作蔗糖含量為20%、NaCl 含量為10%的PDL 液體培養(yǎng)基，按1.3.2 中的方法分裝滅菌與接種，并置于34℃環(huán)境下培養(yǎng)5 d﹒結(jié)果顯示：5組平行培養(yǎng)液分生孢子產(chǎn)量分別為6.40，6.51，6.63，6.99和7.54(×107個/mL)，可見孢子產(chǎn)量在(6.40～7.54)×107個/mL之間波動，平均產(chǎn)量為6.81×107個/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.067 9，表明該優(yōu)化培養(yǎng)條件可重復(fù)性較好，能在液態(tài)發(fā)酵中有效提升冠突散囊菌分生孢子的產(chǎn)量﹒

2.7 不同培養(yǎng)時間對冠突散囊菌分生孢子產(chǎn)量的影響

采用正交試驗(yàn)法得到的優(yōu)化工藝進(jìn)行培養(yǎng)，并于培養(yǎng)的第4，5，6和7 d 觀察并檢測培養(yǎng)液中分生孢子含量，結(jié)果如圖5～圖6所示﹒

圖5 不同培養(yǎng)時間對冠突散囊菌分生孢子產(chǎn)量的影響

圖6 不同培養(yǎng)時間對冠突散囊菌菌膜表面的影響

由圖5可知，當(dāng)?shù)?～5 d 時，分生孢子產(chǎn)量隨時間延長提升較快，其間24 h 的發(fā)酵使分生孢子濃度提高了2.18×107個/mL，此時菌膜均呈現(xiàn)無性型為主的灰綠色(見圖6A 和圖6B)；當(dāng)培養(yǎng)時間超過5 d 時，進(jìn)一步提升發(fā)酵時間對分生孢子的產(chǎn)量影響較小﹒觀察發(fā)酵液可知，從培養(yǎng)的第6 d 起，菌膜表面開始少量生長子囊孢子(見圖6C)；到第7 d 時，菌膜則開始大量附著子囊孢子導(dǎo)致其色澤由先前的灰綠色轉(zhuǎn)化為金黃色(見圖6D)﹒由此表明，冠突散囊菌以有性型作為其繁殖的主要模式，即使在適宜培育無性型的環(huán)境條件下，仍會隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸轉(zhuǎn)化至有性型﹒根據(jù)葛永怡等[16]的研究可知，和冠突散囊菌產(chǎn)孢相關(guān)的MAT 1-1-1 基因在不同生長階段的差異性表達(dá)，可能是造成這一現(xiàn)象的主要原因﹒鑒于子囊孢子的產(chǎn)生會對無性型的觀察與研究造成一定影響，因此本文最終選擇5 d 為產(chǎn)分生孢子的最佳發(fā)酵時間﹒

3 討論與結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，探尋不同的蔗糖濃度、NaCl 濃度、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時間對冠突散囊菌分生孢子的產(chǎn)孢影響﹒結(jié)果表明：PDL 液體培養(yǎng)基添加20%蔗糖和10%NaCl，以及培養(yǎng)溫度34℃和培養(yǎng)時間5 d 是分生孢子的最佳發(fā)酵工藝條件，且孢子產(chǎn)量平均值達(dá)到6.81×107個/mL﹒此發(fā)酵工藝可快速制備冠突散囊菌分生孢子，用以作為菌種代謝特性和分子信息等研究的材料﹒對比鄭欣欣[8]的研究可知，本文所提冠突散囊菌分生孢子產(chǎn)孢工藝與子囊孢子產(chǎn)孢工藝之間有著顯著差異，即不僅需要較高滲透壓和溫度，且其產(chǎn)孢周期也相對較快﹒由Ge等[17]對冠突散囊菌兩性型基因轉(zhuǎn)錄組測序的分析結(jié)果可知，外界因素可調(diào)控冠突散囊菌生殖基因的表達(dá)，能決定真菌最終的繁殖模式﹒總而言之，誘導(dǎo)冠突散囊菌產(chǎn)生分生孢子的關(guān)鍵因素為滲透壓脅迫和一定程度的高溫﹒雖然添加NaCl 和蔗糖都能有效提高培養(yǎng)液滲透壓，但NaCl對分生孢子產(chǎn)生的影響顯著大于蔗糖，可能是Na+能更大限度地改變冠突散囊菌細(xì)胞膜的通透性，促使膜內(nèi)外物質(zhì)的交換，因此誘導(dǎo)產(chǎn)孢效果較好；而蔗糖主要是作為碳源來影響冠突散囊菌的菌絲生長，其通過調(diào)節(jié)生物量的方式影響產(chǎn)孢效果﹒本研究結(jié)果明確了冠突散囊菌分生孢子產(chǎn)孢工藝，為進(jìn)一步了解和發(fā)掘這一微生物資源提供了基礎(chǔ)﹒