廖叢娟，張旭升，樊小容，譚小青，黃戰(zhàn)軍，蔡博治

1.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院皮膚科，廣東 深圳 518172；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515000

尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)是一種生長(zhǎng)抑素樣環(huán)肽，最初是從魚(yú)脊髓尾部腦垂體中分離而來(lái)，1998年首次從人脊髓中被克隆，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)最強(qiáng)的縮血管活性肽，在體內(nèi)具有影響脂質(zhì)和葡萄糖代謝、刺激腎上腺皮質(zhì)激素分泌等作用[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，UⅡ是一種內(nèi)源性促絲裂原，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的包括血管平滑肌細(xì)胞[2]、氣道平滑肌細(xì)胞[3]、心臟成纖維細(xì)胞[4]、腎小球系膜細(xì)胞[5]在內(nèi)的多種細(xì)胞分裂的作用。但UⅡ?qū)w外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞的增殖以及遷移的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要研究UⅡ?qū)w外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移的影響，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 SPF級(jí)雄性SD大鼠由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM高糖培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司。UrotensinⅡ(Rat，200 μg)購(gòu)自康肽生物有限公司。CCK-8購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。Transwell 0.8 μm小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng) 將大鼠處死，取觸須部皮膚，無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗干凈，用顯微剪分離出觸須毛囊，放置于生理鹽水中，將觸須毛囊毛球部剪下，用Ⅰ型膠原酶消化2 h左右，在鏡下觀(guān)察到大量的毛乳頭細(xì)胞游離出來(lái)，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。離心去上清，將毛乳頭細(xì)胞放入T25培養(yǎng)瓶中，37℃5%CO2條件下傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用第2～4代細(xì)胞。

1.2.2 UⅡ?qū)w外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞增殖的影響 將第2～4代細(xì)胞消化、臺(tái)盼藍(lán)染活細(xì)胞計(jì)數(shù)，以3×103/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入100 μL含不同濃度UⅡ的DMEM培養(yǎng)基，UⅡ的濃度分別為10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L，對(duì)照孔加入不含UⅡ的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以鋪板24 h記為測(cè)量的0 h，于48 h采用CCK8法測(cè)量各孔的OD值。測(cè)量時(shí)去除每孔的原培養(yǎng)液，懸空滴加含10%CCK8的新鮮培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中放置1 h后，在酶標(biāo)儀上測(cè)量波段為450 nm的OD值。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式：增殖率=(含UⅡ?qū)嶒?yàn)孔OD值-空白對(duì)照孔OD值)/(不含UⅡ?qū)φ湛譕D值-空白對(duì)照孔OD值)×100%。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞體外遷移能力的影響 提前將細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h后，消化、計(jì)數(shù)，制備成1.0×106/mL的細(xì)胞懸液，往Transwell上室中接種0.1 mL細(xì)胞懸液，下室加入含10-6mol/L UⅡ的DMEM培養(yǎng)基500 μL，對(duì)照孔加入不含藥培養(yǎng)基。于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h后取出上室，用棉簽輕輕拭去上室濾膜內(nèi)面的細(xì)胞，對(duì)遷移至濾膜外面的細(xì)胞用甲醇在室溫條件下固定20 min，結(jié)晶紫染色后，隨機(jī)取4個(gè)視野(40倍鏡)記錄著色的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞體外遷移能力的影響 將毛乳頭細(xì)胞接種至12孔板內(nèi)，使細(xì)胞增殖至融合度為90%，使用無(wú)菌0.2 mL移液器套頭筆直在細(xì)胞上劃出一條傷痕，用PBS洗去死細(xì)胞，加入1 mL含10-6mol/L UⅡ的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照孔加入不含藥培養(yǎng)基。在劃痕后0 h和24 h拍照，在每條傷痕上隨機(jī)選3個(gè)地方，用Image-Pro Plus軟件測(cè)量直徑后取平均數(shù)。創(chuàng)面閉合指數(shù)計(jì)算方法：24 h創(chuàng)面閉合指數(shù)=(0 h直徑-24 h直徑)/0 h直徑×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞增殖的影響 如圖1所示，不同濃度UⅡ (10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L)作用下，CCK8法測(cè)得的毛乳頭細(xì)胞增殖率分別為(122±12.3)%、(141±4.4)%、(136±16.6)%、(137±15.6)%、(116±10.9)%、(109±10.8)%，其中10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L UⅡ顯著促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖，分別與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 CCK8法檢測(cè)UⅡ?qū)w外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞增殖的影響

圖2 Transwell法檢測(cè)UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞遷移能力的影響(×100)

2.2 UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞遷移的影響 如圖2A～2C所示，加藥組的Transwell濾膜結(jié)晶紫染色結(jié)果明顯比未加藥組深，通過(guò)IPP軟件計(jì)算著色的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示加藥組穿過(guò)Transwell濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組(圖2D)，說(shuō)明10-6mol/L和10-7mol/L的UⅡ處理組都能顯著促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞遷移，分別與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，傷口愈合程度不同代表不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移程度的差異。如圖3所示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各組細(xì)胞的傷痕平均直徑都越來(lái)越小。但是對(duì)照組的愈合程度明顯低于UⅡ組，根據(jù)愈合指數(shù)計(jì)算，對(duì)照組及10-6mol/LUⅡ組24 h創(chuàng)面愈合指數(shù)分別為0.18±0.13、0.78±0.09，其中10-6mol/L UⅡ組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明UⅡ可促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞遷移。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞遷移能力的影響(×100)

3 討論

位于毛囊基底部的毛乳頭細(xì)胞可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖分化形成毛囊，在毛發(fā)生長(zhǎng)周期中起著重要的誘導(dǎo)、分化、維持和調(diào)節(jié)作用，對(duì)男性脫發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展影響重大[6]。研究發(fā)現(xiàn)，將體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞移植入裸鼠體內(nèi)，可誘導(dǎo)出大量毛囊和毛發(fā)纖維，形成肉眼可見(jiàn)的毛發(fā)，提示毛乳頭細(xì)胞是產(chǎn)生毛發(fā)的關(guān)鍵細(xì)胞[6-7]。因此毛乳頭細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性是值得關(guān)注的。

許多研究證實(shí)，UⅡ?qū)Χ喾N類(lèi)型的細(xì)胞具有促增殖效應(yīng)，WATANABE等[8]報(bào)道，UⅡ可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞中3H-胸腺嘧啶摻入，該刺激呈濃度依賴(lài)性，在UⅡ濃度為50 nmol/L時(shí)達(dá)最大效應(yīng)，禹曉童等[9]發(fā)現(xiàn)UⅡ可通過(guò)介導(dǎo)肝臟干細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，汪華林等[10]發(fā)現(xiàn)UⅡ通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度從而激活鈣調(diào)速、蛋白激酶C、絲裂原活化蛋白激酶等多條途徑，促進(jìn)乳鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖。這些研究均提示UⅡ是重要的促絲裂原，可通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。另外，前期研究發(fā)現(xiàn)UⅡ具有促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞遷移的能力[2]。然而UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞增殖和遷移能力的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用體外分離、培養(yǎng)的大鼠毛乳頭細(xì)胞，進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察不同濃度的UⅡ?qū)γ轭^細(xì)胞增殖和遷移的影響。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果提示，一定濃度范圍內(nèi)的UⅡ可促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖，其特點(diǎn)是隨著UⅡ干預(yù)濃度的升高，毛乳頭細(xì)胞存活率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，其中10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L UⅡ顯著促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖，上述結(jié)果與何艷華等報(bào)道的一定濃度的UⅡ可促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖且促增殖能力隨濃度先增加后降低的結(jié)論一致[11]。同時(shí)Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10-6mol/L、10-7mol/L UⅡ可促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞遷移。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，10-6mol/L UⅡ組的細(xì)胞在24 h幾乎達(dá)到完全愈合，愈合指數(shù)高達(dá)0.78，而對(duì)照組在48 h的愈合指數(shù)僅為0.18，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見(jiàn)，UⅡ不僅能促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖，也可以促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞遷移。

綜上所述，本研究以尾加壓素Ⅱ作為干預(yù)因素，證明尾加壓素Ⅱ能促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，還可提高毛乳頭細(xì)胞的體外遷移能力，為揭示UⅡ的生物學(xué)效應(yīng)提供新證據(jù)，為臨床防治脫發(fā)提供一種新的策略與靶點(diǎn)。