邢曼 ,張安冬 ,馮戟瑋 ,劉建黨 ,李雯 ,陳躍來(lái) ,謝旭彬
(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437)
根據(jù)國(guó)際尿控協(xié)會(huì)的定義,逼尿肌無(wú)力(detrusor underactivity, DU)是指膀胱逼尿肌收縮能力降低或者逼尿肌持續(xù)收縮時(shí)間縮短,而導(dǎo)致的膀胱不能完全排空或者排空延遲[1]。其主要癥狀為排尿困難、排尿躊躇、排尿不盡甚至發(fā)生尿潴留。針刺是中醫(yī)臨床常用治療排尿功能障礙性疾病的主要方法之一,研究證明針刺治療 DU療效顯著[2-3]。本實(shí)驗(yàn)以逼尿肌無(wú)力大鼠為研究對(duì)象,采用電針次髎、會(huì)陽(yáng)穴治療,借助尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)和離體逼尿肌肌條牽拉實(shí)驗(yàn),動(dòng)態(tài)角度觀察(電針治療后2 h、24 h、48 h、72 h)電針的效應(yīng),以期在一定程度評(píng)價(jià)電針對(duì)逼尿肌收縮功能的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)效應(yīng),為臨床電針治療DU提供依據(jù)。
SPF級(jí)雌性 Wistar大鼠 160只,體質(zhì)量(230±20)g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)為 SCXK(京)2016-0011,在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境安靜,每日光照12 h,自由攝水飲食。室內(nèi)恒溫20℃~24℃,濕度60%~70%,每籠 5~6只大鼠,籠內(nèi)墊料保持清潔干燥。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查(No.PZSHUTCM190315011),符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)。
1%戊巴比妥鈉(Sigma公司);0.9%氯化鈉注射液(華裕制藥有限公司);新斯的明(Sigma公司);Kreb’s液(Sigma公司);生理電信號(hào)記錄儀(香港興萬(wàn)電子儀器公司);拉力傳感器(揚(yáng)州科動(dòng)電子有限責(zé)任公司);氣體減壓閥(永嘉縣明創(chuàng)閥門(mén)有限公司);硬脊膜外麻醉導(dǎo)管(上海上醫(yī)康鴿醫(yī)用器材有限責(zé)任公司);無(wú)菌針灸針(蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司);電針儀治療(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)儀(加拿大Laborie公司);微量灌注泵(蘇州醫(yī)療器械公司)。
參照唐嘉佑等[4]的方法建立逼尿肌無(wú)力(DU)大鼠模型。造模2周后,檢測(cè)尿動(dòng)力以分析模型制備情況。若大鼠膀胱容量增加、殘余尿量增加、平均排尿速度下降,即可認(rèn)為逼尿肌無(wú)力模型制備成功。
160只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、電針組和藥物組,每組40只。假手術(shù)組不做造模處理;模型組造模成功后不予治療;電針組造模成功后,電針次髎、會(huì)陽(yáng)穴[5],予電針連續(xù)波,頻率為30 Hz,電流輸出強(qiáng)度為1 mA,持續(xù)20 min,每日1次,連續(xù)3 d;藥物組造模成功后,予皮下注射0.1%新斯的明0.02 mL,每日2次,連續(xù)3 d。為了進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察,每組又隨機(jī)分為4小組(對(duì)應(yīng)不同時(shí)段,處理后2 h、24 h、48 h、72 h)。每小組10只。
1.5.1 尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)
大鼠腹腔麻醉后,將其固定于操作臺(tái)上,輕壓大鼠下腹部,盡量將膀胱中尿液排盡。用石蠟油潤(rùn)滑導(dǎo)管的前部,經(jīng)尿道插入膀胱大約 3 cm。打開(kāi)微量灌注泵,以12 mL/h的速度勻速灌注生理鹽水,至有尿液流出后,即可關(guān)閉微量灌注泵。待大鼠自主排尿結(jié)束后,導(dǎo)管拔出,另取一根直徑1 mm,長(zhǎng)度6 cm硬膜外導(dǎo)管插入膀胱,收集殘余尿量并記錄,保存數(shù)據(jù)。計(jì)算最大膀胱容量(mL)=灌注時(shí)間(s)×灌注速度(mL/s);平均排尿速度(mL/s)=[最大膀胱容量(mL)-殘余尿量(mL)]/排尿時(shí)間(s)。
1.5.2 離體逼尿肌條牽拉實(shí)驗(yàn)
大鼠處死后完整取下膀胱,放入Kreb's液中。將膀胱剪成約10 mm×3 mm×3 mm大小的肌條,在肌條兩端系上絲線。將逼尿肌肌條的一端懸掛于拉力傳感器上,另一端固定于水浴槽的底部,確保此時(shí)肌條處于松弛狀態(tài)。給予95% O2+5% CO2混合氣體,放置30 min。將張力逐漸增加0.2 g,放置30 min后,將張力逐漸增加至0.75 g,開(kāi)始記錄肌條自發(fā)性收縮幅度及頻率,記錄 60 min。數(shù)據(jù)用多功能生理記錄儀記錄,設(shè)置記錄軟件的具體參數(shù)。由軟件分析各組大鼠膀胱逼尿肌肌條自發(fā)性收縮的幅度和頻率。
使用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊時(shí)采用方差分析進(jìn)行比較,兩兩比較采用LSD法;方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1.1 各組大鼠膀胱容量比較
處理后各時(shí)間段,模型組大鼠膀胱容量高于假手術(shù)組(P<0.05);電針組、藥物組膀胱容量低于模型組(P<0.05);電針組與藥物組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);各組不同時(shí)間段膀胱容量組內(nèi)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示,逼尿肌無(wú)力大鼠膀胱容量高于假手術(shù)組,處理后各時(shí)間段,電針治療及皮下注射新斯的明均能有效降低逼尿肌無(wú)力大鼠膀胱容量。詳見(jiàn)表1。
表1 各組大鼠膀胱容量比較 (±s,mL)
表1 各組大鼠膀胱容量比較 (±s,mL)
注:與假手術(shù)組比較1)P<0.05;與模型組比較2)P<0.05
組別 n 處理后2 h 處理后24 h 處理后48 h 處理后72 h假手術(shù)組 10 0.973±0.410 0.975±0.412 0.918±0.213 0.907±0.288模型組 10 1.521±0.3631) 1.706±0.9121) 1.518±0.3951) 1.438±0.4631)電針組 10 1.263±0.4712) 1.131±0.5462) 1.053±0.3452) 1.028±0.3792)藥物組 10 1.053±0.2672) 1.103±0.4012) 1.090±0.4102) 0.991±0.4392)
2.1.2 各組大鼠殘余尿量比較
處理后各時(shí)間段,模型組大鼠殘余尿量高于假手術(shù)組(P<0.05);藥物組殘余尿量低于模型組(P<0.05);電針組與藥物組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);處理后2 h、24 h和48 h,電針組殘余尿量低于模型組(P<0.05),處理后 72 h,電針組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組不同時(shí)間段殘余尿量組內(nèi)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示,逼尿肌無(wú)力大鼠殘余尿量高于假手術(shù)組,處理后各時(shí)間段,電針治療及皮下注射新斯的明均能有效降低逼尿肌無(wú)力大鼠殘余尿量。詳見(jiàn)表2。
表2 各組大鼠殘余尿量比較 (±s,mL)
表2 各組大鼠殘余尿量比較 (±s,mL)
注:與假手術(shù)組比較1)P<0.05;與模型組比較2)P<0.05
組別 n 處理后2 h 處理后24 h 處理后48 h 處理后72 h假手術(shù)組 10 0.313±0.140 0.277±0.227 0.216±0.200 0.240±0.213模型組 10 0.956±0.4331) 1.161±0.3361) 1.068±0.3931) 0.910±0.1941)電針組 10 0.400±0.4592) 0.770±0.6612) 0.559±0.2361)2) 0.747±0.3151)藥物組 10 0.374±0.3212) 0.686±0.4482) 0.420±0.2042) 0.438±0.2902)
2.1.3 各組大鼠平均排尿速度比較
處理后各時(shí)間段,模型組大鼠平均排尿速度低于假手術(shù)組(P<0.05);處理后2 h、24 h電針組平均排尿速度高于模型組(P<0.05),處理后48 h、72 h,電針組平均排尿速度與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);處理后2 h、24 h和48 h,藥物組平均排尿速度高于模型組(P<0.05),處理后72 h藥物組平均排尿速度與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);假手術(shù)組、模型組、藥物組不同時(shí)間段平均排尿速度組內(nèi)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針治療后2 h平均排尿速度高于其他3個(gè)時(shí)間段(P<0.05)。以上結(jié)果提示,逼尿肌無(wú)力大鼠平均排尿速度低于假手術(shù)組,電針在治療后2 h和24 h提升逼尿肌無(wú)力大鼠平均排尿速度,皮下注射新斯的明在治療后2 h、24 h和48 h提升逼尿肌無(wú)力大鼠平均排尿速度;電針治療對(duì)逼尿肌無(wú)力大鼠的平均排尿速度改善在2 h最明顯。詳見(jiàn)表3。
表3 各組大鼠平均排尿速度比較 (±s,mL/s)
表3 各組大鼠平均排尿速度比較 (±s,mL/s)
注:與假手術(shù)組比較1)P<0.05;與模型組比較2)P<0.05;與同組處理后2 h比較3)P<0.05
組別 n 處理后2 h 處理后24 h 處理后48 h 處理后72 h假手術(shù)組 10 0.028±0.014 0.025±0.014 0.029±0.017 0.027±0.015模型組 10 0.005±0.0021) 0.005±0.0011) 0.005±0.0021) 0.007±0.0031)電針組 10 0.019±0.0102) 0.008±0.0031)2)3) 0.006±0.0023) 0.006±0.0031)3)藥物組 10 0.018±0.0122) 0.010±0.0061)2) 0.013±0.0012) 0.014±0.0071)
2.2.1 各組大鼠離體逼尿肌條收縮幅度比較
處理后各時(shí)間段,模型組大鼠離體逼尿肌條收縮幅度低于假手術(shù)組(P<0.05);處理后2 h、24 h和48 h,電針組離體逼尿肌條收縮幅度高于模型組(P<0.05);處理后 72 h,電針組離體逼尿肌條收縮幅度與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);處理后2 h、24 h,藥物組離體逼尿肌條收縮幅度高于模型組(P<0.05);處理后 48 h、72 h,藥物組離體逼尿肌條收縮幅度與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);假手術(shù)組、模型組、藥物組不同時(shí)間段離體逼尿肌條收縮幅度組內(nèi)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針后2 h肌條收縮幅度大于其他 3個(gè)時(shí)間段,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示,逼尿肌無(wú)力模型組大鼠離體逼尿肌肌條收縮幅度低于假手術(shù)組,電針能在治療后2 h、24 h和48 h有效提升逼尿肌無(wú)力大鼠離體逼尿肌條收縮幅度,皮下注射新斯的明能在治療后 2 h和24 h有效提升逼尿肌無(wú)力大鼠離體逼尿肌條收縮幅度。且電針治療后2 h逼尿肌無(wú)力大鼠離體逼尿肌條收縮幅度的改善最明顯。詳見(jiàn)表4。
表4 各組大鼠膀胱離體逼尿肌條收縮幅度比較 (±s,g)
表4 各組大鼠膀胱離體逼尿肌條收縮幅度比較 (±s,g)
注:與假手術(shù)組比較1)P<0.05;與模型組比較2)P<0.05;與電針組比較3)P<0.05;與同組處理后2 h比較4)P<0.05
組別 n 處理后2 h 處理后24 h 處理后48 h 處理后72 h假手術(shù)組 10 0.328±0.179 0.356±0.226 0.353±0.183 0.380±0.128模型組 10 0.052±0.0211) 0.096±0.0421) 0.073±0.0191) 0.084±0.0171)電針組 10 0.219±0.0382) 0.169±0.0472)4) 0.190±0.0282)4) 0.110±0.0231)4)藥物組 10 0.134±0.0442) 0.162±0.0562) 0.137±0.0561)3) 0.139±0.0841)
2.2.2 各組大鼠離體逼尿肌條收縮頻率比較
處理后各時(shí)間段,模型組大鼠離體逼尿肌條收縮頻率低于假手術(shù)組(P<0.05);處理后2 h、24 h,電針組離體逼尿肌條收縮頻率高于模型組(P<0.05);處理后 48 h、72 h,電針組離體逼尿肌條收縮頻率與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);處理后2 h、24 h和48 h,藥物組離體逼尿肌條收縮頻率高于模型組(P<0.05);處理后 72 h,藥物組離體逼尿肌條收縮頻率與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);各組不同時(shí)間段離體逼尿肌條收縮頻率組內(nèi)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示,逼尿肌無(wú)力模型組大鼠離體逼尿肌肌條收縮頻率低于假手術(shù)組,電針能在治療后2 h、24 h有效提升逼尿肌無(wú)力大鼠離體逼尿肌條收縮頻率,皮下注射新斯的明能在治療后 2 h、24 h、48 h有效提升逼尿肌無(wú)力大鼠離體逼尿肌條收縮頻率,電針治療及皮下注射新斯的明在處理后4個(gè)時(shí)間段對(duì)逼尿肌無(wú)力大鼠的離體逼尿肌條收縮幅度改善并無(wú)差異。詳見(jiàn)表5。
表5 各組大鼠膀胱離體逼尿肌條收縮頻率比較 (±s,次/min)
表5 各組大鼠膀胱離體逼尿肌條收縮頻率比較 (±s,次/min)
注:與假手術(shù)組比較1)P<0.05;與模型組比較2)P<0.05;與電針組比較3)P<0.05
組別 n 處理后2 h 處理后24 h 處理后48 h 處理后72 h假手術(shù)組 10 3.235±0.108 3.358±0.206 2.803±0.167 2.983±0.769模型組 10 0.482±0.3731) 0.859±0.9771) 0.967±1.0071) 1.250±0.0161)電針組 10 2.725±0.0432) 1.825±0.0511)2) 1.808±0.9701) 2.183±0.0291)藥物組 10 1.983±0.7872) 1.985±0.0421)2) 2.100±0.6412)3) 2.175±0.0671)
逼尿肌無(wú)力是臨床常見(jiàn)的排尿功能障礙性疾病,該病雖不對(duì)生命造成威脅,但對(duì)患者的生活和社交產(chǎn)生嚴(yán)重影響。排尿不盡等癥狀也會(huì)使患者產(chǎn)生害羞情緒,影響患者的心理健康。而長(zhǎng)時(shí)間的治療也會(huì)加重患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),帶來(lái)了很多經(jīng)濟(jì)問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。西醫(yī)對(duì)于DU的主要治療方法包括導(dǎo)尿治療、藥物治療、骶神經(jīng)調(diào)節(jié)治療等。此類(lèi)療法雖能改善DU癥狀,但局限性強(qiáng)且副作用明顯,遠(yuǎn)期效果不理想,因此不能長(zhǎng)期有效地對(duì)DU進(jìn)行治療[6-7]。膀胱逼尿肌收縮性降低是DU的病理基礎(chǔ),在逼尿肌無(wú)力的發(fā)生中占有重要位置,是導(dǎo)致DU臨床癥狀的主要原因。目前業(yè)界廣泛認(rèn)可的DU發(fā)病機(jī)制主要有兩種學(xué)說(shuō),神經(jīng)源性機(jī)制學(xué)說(shuō)和肌源性機(jī)制學(xué)說(shuō)。神經(jīng)源性機(jī)制學(xué)說(shuō)認(rèn)為,膀胱的功能活動(dòng)受神經(jīng)調(diào)控,因此膀胱興奮性的改變與神經(jīng)系統(tǒng)功能改變密切相關(guān)。感知功能受損、傳入神經(jīng)通路受損、排尿中樞受損和傳出神經(jīng)通路受損都會(huì)導(dǎo)致 DU的發(fā)生[8]。然而在切斷神經(jīng)控制后,離體逼尿肌肌條仍可產(chǎn)生自發(fā)性的節(jié)律性收縮,因此肌源性機(jī)制認(rèn)為逼尿肌自身興奮性的變化同樣參與了膀胱興奮性的調(diào)控,其自發(fā)興奮性與膀胱來(lái)源可興奮細(xì)胞(如 ICCs)有關(guān),而該類(lèi)可興奮細(xì)胞的興奮性下降可能會(huì)引起逼尿肌無(wú)力[9-10]。
膀胱逼尿肌無(wú)力屬于中醫(yī)學(xué)“癃閉”的范疇。該疾病的病因病機(jī)與膀胱氣化功能失常有關(guān),腎虛不能溫陽(yáng)化氣行水,則膀胱氣化失司,從而產(chǎn)生排尿不暢,尿潴留等癥狀[11]。該病病位主要在腎與膀胱,故本病的治則主要以補(bǔ)腎益氣,助膀胱氣化為主[12]。自古以來(lái)就有針灸治療排尿障礙的記載,如《靈樞》:“內(nèi)閉不得溲,刺足少陰、太陽(yáng)于骶上以長(zhǎng)針”。本研究方案選取骶部穴位次髎、會(huì)陽(yáng)穴加以電針治療DU?!鹅`樞·海論》:“夫十二經(jīng)脈者,內(nèi)屬于府藏,外絡(luò)于支節(jié)”[13],說(shuō)明五臟六腑與經(jīng)脈之間關(guān)系密切,每條經(jīng)脈都有所絡(luò)屬的臟腑,因此該經(jīng)脈上的腧穴可調(diào)節(jié)相應(yīng)的臟腑功能活動(dòng)[14]。次髎、會(huì)陽(yáng)穴是足太陽(yáng)膀胱經(jīng)上的穴位,具有補(bǔ)益腎氣、助膀胱氣化之功。導(dǎo)師團(tuán)隊(duì)在多年的臨床實(shí)踐中,應(yīng)用經(jīng)穴-臟腑相關(guān)學(xué)說(shuō),形成了以膀胱經(jīng)次髎、會(huì)陽(yáng)穴位為主的有效組穴方案,可調(diào)節(jié)膀胱功能,改善排尿功能障礙性疾病癥狀,療效確切[15-18]。次髎穴定位于腰骶部第 2骶后孔,該穴穴下神經(jīng)與盆神經(jīng)重合進(jìn)入骶髓神經(jīng)節(jié)段,調(diào)控排尿中樞部位;會(huì)陽(yáng)穴定位于骶部,尾骨旁開(kāi)0.5寸,穴下傳入神經(jīng)恰與支配膀胱的盆神經(jīng)以及陰部神經(jīng)相重合。針刺次髎、會(huì)陽(yáng)可激活與排尿有關(guān)的周?chē)窠?jīng),而且傳入神經(jīng)元將刺激傳至脊髓并經(jīng)上升束至丘腦進(jìn)行整合,調(diào)節(jié)副交感神經(jīng)的興奮性,從而增強(qiáng)逼尿肌收縮,改善DU癥狀。
尿動(dòng)力學(xué)(Urodynamics, UD)是依據(jù)流體力學(xué)原理,采用電生理學(xué)方法及傳感器技術(shù)研究?jī)?chǔ)尿和排尿生理過(guò)程及功能障礙的一門(mén)科學(xué),能較準(zhǔn)確地判斷膀胱逼尿肌功能狀態(tài),是反映膀胱功能的黃金標(biāo)準(zhǔn)[19]。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)觀察到電針次髎、會(huì)陽(yáng)穴可以改善大鼠尿動(dòng)力,降低膀胱容量和殘余尿量,提高排尿速度,且電針治療2 h后對(duì)排尿速度的改善優(yōu)于其他3個(gè)時(shí)間段。離體實(shí)驗(yàn)是指將目標(biāo)組織從體內(nèi)分離后,放置于模擬體內(nèi)環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)液中,在一定條件下進(jìn)行研究。與在體實(shí)驗(yàn)相比,離體實(shí)驗(yàn)去除了神經(jīng)體液等因素的影響,操作簡(jiǎn)單,條件易于控制。DU的病理基礎(chǔ)為膀胱逼尿肌收縮性降低,本研究采用離體逼尿肌條牽拉實(shí)驗(yàn),更加直觀地觀察電針對(duì)逼尿肌條收縮功能的調(diào)節(jié)效應(yīng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知,電針可以增加離體逼尿肌條收縮的幅度和頻率,且在治療后2 h對(duì)逼尿肌條的收縮幅度的改善效應(yīng)最佳。新斯的明為抗膽堿酯酶藥物,可通過(guò)抑制膽堿酯酶活性、減少乙酰膽堿分解,增強(qiáng)局部乙酰膽堿濃度,刺激肌肉收縮[20],是臨床治療逼尿肌無(wú)力導(dǎo)致尿潴留的常用藥物,因此本研究的藥物組選擇新斯的明與電針調(diào)節(jié)逼尿肌無(wú)力的效應(yīng)做對(duì)照。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,電針和皮下注射新斯的明在尿動(dòng)力學(xué)方面的改善效應(yīng)相近,其中對(duì)膀胱容量和殘余尿量的調(diào)節(jié)均可維持 72 h,皮下注射新斯的明對(duì)平均排尿速度的改善持續(xù)時(shí)間略長(zhǎng)。離體逼尿肌條牽拉實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示,電針和皮下注射新斯的明在治療后24 h內(nèi)對(duì)逼尿肌條收縮幅度和頻率的提高效果相近。新斯的明雖可增強(qiáng)逼尿肌收縮功能,改善逼尿肌無(wú)力造成的排尿困難、尿潴留等癥狀,但容易出現(xiàn)惡心嘔吐、心動(dòng)過(guò)速等不良反應(yīng)。對(duì)于臨床逼尿肌無(wú)力的患者,予新斯的明治療的同時(shí)可采取電針治療,以減少藥量,降低藥物造成的不良反應(yīng)。