馬逸群， 邵麗詩(shī)， 萬(wàn)珊杉， 楊揚(yáng)， 李嘉琦， 王家平△

1昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院影像科(云南昆明 650500)； 2云南昆鋼醫(yī)院放射科(云南昆明 650500)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種來(lái)自于動(dòng)物骨髓腔，具有多分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞，可通過(guò)誘導(dǎo)分化為多種組織細(xì)胞，包括骨、軟骨、肌肉、肌腱、脂肪及其他結(jié)締組織[1-2]。隨著生物細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，BMSCs現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于組織工程學(xué)。大量研究證明，移植的BMSCs可歸巢至受損的組織器官，通過(guò)分化機(jī)制和旁分泌機(jī)制，對(duì)急性腎損傷、慢性腎病、缺血再灌注腎損傷和心肌損傷都有較好的治療效果[3-5]，是組織工程研究領(lǐng)域理想的種子工程細(xì)胞。由于BMSCs具有高度黏附塑料培養(yǎng)瓶的特性，建立有效的貼壁細(xì)胞分離方法對(duì)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展尤為重要。實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)的分離方法多為胰蛋白酶消化法[6-8]，該方法對(duì)BMSCs的分離效率較低，傳代時(shí)間較久。2019年9—11月，本研究對(duì)胰蛋白酶消化合并細(xì)胞刮刮取法的分離培養(yǎng)方法進(jìn)行探索，改進(jìn)了傳統(tǒng)的分離方法，以期在較短的時(shí)間內(nèi)獲得更多數(shù)量的BMSCs，為BMSCs進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠9只，體重(200±15)g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供；取材過(guò)程符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清(FBS)、培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素、胰蛋白酶-0.25%EDTA(美國(guó)Gibco公司)；離心管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(NEST公司)；細(xì)胞刮(Corning公司)；CKX41倒置相差顯微鏡(日本Olympus 公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSCs的提取與培養(yǎng) 按照文獻(xiàn)所述方法[9]，將9只大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉并脫頸處死，置于75%酒精中浸泡5 min。于超凈工作臺(tái)中取股骨并置于含有PBS的培養(yǎng)皿中，剪斷股骨的干骺端，充分暴露骨髓腔；用培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，直至沖洗液變透亮；分別收集每只大鼠的細(xì)胞懸液于15 mL離心管中，2 000 r/min離心30 min，棄上清液，用PBS吹打重懸后再以1 600 r/min離心10 min后去上清，加入含10%FBS與1%青鏈霉素的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；將細(xì)胞懸液分別接種在9個(gè)塑料培養(yǎng)瓶中并置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育。24 h后首次換液，以后每3 d換液1次。1周后于倒置顯微鏡下觀察BMSCs生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)開(kāi)始傳代。

1.2.2 分組與處理 將9瓶BMSCs隨機(jī)分為3組，A組(n=3)：利用細(xì)胞刮直接刮取貼壁生長(zhǎng)的BMSCs，收集細(xì)胞懸液于15 mL離心管中；B組(n=3)：向培養(yǎng)瓶中加入1 mL胰蛋白酶-0.25%EDTA溶液于室溫下消化3 min，鏡下觀察細(xì)胞變圓、間隙變寬時(shí)加入3 mL完全培養(yǎng)液終止消化，用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁，收集細(xì)胞懸液于15 mL離心管中；C組(n=3)：向培養(yǎng)瓶中加入1 mL胰蛋白酶-0.25%EDTA溶液于室溫下消化2 min，加入3 mL完全培養(yǎng)液終止消化，再利用細(xì)胞刮刮取貼壁生長(zhǎng)的BMSCs，收集細(xì)胞懸液于15 mL離心管中。將離心管配平后以1 500 r/min離心10 min并棄上清，PBS清洗3次徹底去除胰蛋白酶-0.25%EDTA溶液，用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1∶3傳代后每3 d換液1次，每次換液時(shí)去除懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，直至各組BMSCs生長(zhǎng)融合至80%～90%。

1.3 觀察指標(biāo) 使用3種方法進(jìn)行傳代后，于倒置顯微鏡下(100×)隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察原代培養(yǎng)瓶中剩余細(xì)胞的數(shù)量、傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)數(shù)目與密度，每天記錄每高倍視野細(xì)胞數(shù)目、各組BMSCs傳代后到收獲所需的時(shí)間。采用ImageJ軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 傳代后原代培養(yǎng)瓶剩余貼壁細(xì)胞的數(shù)量 A組與C組貼壁細(xì)胞數(shù)目較少，鏡下多數(shù)區(qū)域幾乎未見(jiàn)BMSCs，分離較為徹底；B組瓶底可見(jiàn)較多貼壁細(xì)胞，呈圓形，形態(tài)相似，大小均一。見(jiàn)圖1。

注：A：A組；B：B組；C：C組

2.2 傳代后每高倍視野細(xì)胞數(shù)目 第1天時(shí)C組BMSCs貼壁數(shù)目明顯多于其余兩組(P<0.001)，同時(shí)各組培養(yǎng)基中可見(jiàn)少量懸浮細(xì)胞。第2天起C組貼壁細(xì)胞開(kāi)始呈現(xiàn)魚(yú)群狀分布趨勢(shì)，其余兩組仍呈散在分布。第7天時(shí)，C組細(xì)胞幾乎長(zhǎng)滿瓶底，BMSCs生長(zhǎng)融合達(dá)80%～90%，其余兩組細(xì)胞間隙較大，仍未達(dá)到收獲標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表1。

表1 傳代后每天各組培養(yǎng)瓶中BMSCs數(shù)量變化 個(gè)/視野

2.3 傳代后到收獲所需時(shí)間 C組在傳代后第5天便有1瓶BMSCs長(zhǎng)滿瓶底，其余各瓶第7天時(shí)也幾乎達(dá)到收獲標(biāo)準(zhǔn)。A組從傳代到收獲所用時(shí)間為(8.1±0.8)d；B組所用時(shí)間為(10.3±0.8)d；C組所用時(shí)間為(6.7±0.9)d。C組收獲時(shí)間明顯短于其余兩組(P<0.001)。

3 討論

隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞被逐漸應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)工程。作為干細(xì)胞家族的主要成員，BMSCs因其多能性和易分離性已被廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)和再生領(lǐng)域[10]。同時(shí)，使用BMSCs避免了類似于胚胎干細(xì)胞、羊水干細(xì)胞及人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的倫理爭(zhēng)議。已有的研究表明，移植入體內(nèi)的BMSCs可在SDF-1/CXCR4生物軸的趨化作用下歸巢至受損組織，通過(guò)多種機(jī)制對(duì)受損組織進(jìn)行修復(fù)[11]，早期的研究證明BMSCs可分化為相應(yīng)受損組織的細(xì)胞，對(duì)受損組織進(jìn)行修復(fù)，但分化的細(xì)胞數(shù)量較少；近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌諸多生長(zhǎng)因子與外泌體，提示其旁分泌/內(nèi)分泌作用可對(duì)受損組織發(fā)揮保護(hù)作用[12-13]；Gharaibeh等[14]認(rèn)為移植入體內(nèi)的干細(xì)胞的終末分化能力不是其促進(jìn)受損細(xì)胞再生潛能的決定因素，而干細(xì)胞的旁分泌作用對(duì)組織再生修復(fù)的影響更大。有學(xué)者利用干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物受損組織進(jìn)行干預(yù)，但其修復(fù)作用目前尚存在爭(zhēng)議[15-16]。此外，BMSCs可自體移植，無(wú)免疫排斥、致腫瘤性且來(lái)源廣泛，可從多種組織中分離獲取，是較為理想的細(xì)胞治療選擇。由于BMSCs在骨髓中含量較低且具有高度貼壁生長(zhǎng)的特性，因此如何提取、分離、純化BMSCs對(duì)其傳代和生長(zhǎng)具有重要的意義。

目前常用的BMSCs提取方法主要有密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀法、全骨髓培養(yǎng)法等[17-18]，本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行BMSCs的培養(yǎng)和提純，根據(jù)BMSCs在完全培養(yǎng)液中具有貼壁生長(zhǎng)的特性，定期換液，去除懸浮細(xì)胞，從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的，獲得的BMSCs總體形態(tài)均勻，數(shù)量較多。在BMSCs傳代過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室常用分離貼壁細(xì)胞的方法是消化劑消化法，該方法利用生化原理降解組織細(xì)胞之間的蛋白，使組織松散、細(xì)胞易分離，常用的消化劑包括具有消化蛋白質(zhì)作用的胰蛋白酶、膠原酶、分離酶和鏈霉蛋白酶，以及與Ca2+、Mg2+結(jié)合、具有分散作用的乙二胺四乙酸等，經(jīng)處理的BMSCs在細(xì)胞骨架張力的作用下可皺縮成球形，細(xì)胞間距擴(kuò)大，用吸管反復(fù)吹打可將多數(shù)細(xì)胞沖洗下來(lái)，該方法在操作時(shí)涉及到消化和離心等步驟，使用試劑較多，耗時(shí)較長(zhǎng)、操作復(fù)雜，同時(shí)該方法存在較多缺陷，如消化時(shí)間不易掌握，消化時(shí)間過(guò)短細(xì)胞不易脫落，傳代效率低；消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致細(xì)胞膜的破壞，引起細(xì)胞壞死。細(xì)胞刮分離細(xì)胞法是利用機(jī)械外力將貼壁細(xì)胞直接從培養(yǎng)瓶底刮除的方法，從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，該方法分離細(xì)胞的效率優(yōu)于胰酶消化法，經(jīng)處理后的原代培養(yǎng)瓶貼壁細(xì)胞明顯更少，獲得的傳代細(xì)胞數(shù)量更多、生長(zhǎng)更快，收獲時(shí)間更短；該方法在刮取過(guò)程中可能導(dǎo)致部分緊密貼壁的細(xì)胞破裂，多數(shù)細(xì)胞不受影響，對(duì)細(xì)胞總體損傷較小。胰蛋白酶消化合并細(xì)胞刮刮取法是先利用胰酶處理細(xì)胞，使細(xì)胞之間相互分離，細(xì)胞與培養(yǎng)瓶之間的黏附作用減弱，此時(shí)細(xì)胞刮作用于細(xì)胞時(shí)，貼壁的細(xì)胞相對(duì)易于脫落，與直接刮取細(xì)胞法相比，該方法對(duì)細(xì)胞的損傷更小，提取效率更高。收獲時(shí)間指BMSCs從傳代后到長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底、需再次傳代所用的時(shí)間，是評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)速度和存活狀態(tài)的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中C組平均用時(shí)最短，且與其他兩組相比有顯著差異，證明胰蛋白酶消化合并細(xì)胞刮刮取法對(duì)細(xì)胞分離效果最好，同時(shí)對(duì)細(xì)胞損傷也最小。

該實(shí)驗(yàn)在傳代過(guò)程中需注意以下幾點(diǎn)：(1)使用低糖DMEM培養(yǎng)基并維持其pH值在7.2左右；(2)生長(zhǎng)液中胎牛血清濃度控制在10%～20%為宜，濃度過(guò)低的血清缺乏生長(zhǎng)因子使細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，而濃度過(guò)高又易引起細(xì)胞老化；(3)分離前應(yīng)先使用胰蛋白酶消化1～3 min，消化時(shí)間過(guò)短細(xì)胞與培養(yǎng)瓶黏附作用較強(qiáng)，刮取過(guò)程中仍會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞損傷死亡，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致細(xì)胞膜的破壞，同樣引起細(xì)胞死亡；(4)使用細(xì)胞刮刮取BMSCs時(shí)，刀頭與培養(yǎng)瓶底角度不宜過(guò)大，刮取過(guò)程應(yīng)盡量保持力度均一，并重復(fù)刮取3次以上；(5)體外培養(yǎng)的BMSCs增長(zhǎng)速度與其數(shù)目和密度相關(guān)，BMSCs的生長(zhǎng)狀態(tài)及密度是判斷其傳代時(shí)機(jī)的重要依據(jù)，在鏡下觀察可見(jiàn)生長(zhǎng)活力較好的BMSCs常呈多邊形且邊緣銳利、透光均勻、大小均一，多個(gè)細(xì)胞可呈魚(yú)群狀或旋渦狀分布，同時(shí)BMSCs生長(zhǎng)融合達(dá)80%～90%時(shí)為傳代的最佳時(shí)機(jī)。本實(shí)驗(yàn)將原代BMSCs培養(yǎng)至8 d時(shí)觀察到貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、數(shù)量較多，適宜傳代。本實(shí)驗(yàn)對(duì)BMSCs分離培養(yǎng)的方法進(jìn)行了改進(jìn)，提高了BMSCs的傳代培養(yǎng)技術(shù)的可行性。此方法操作簡(jiǎn)單、對(duì)細(xì)胞的損傷較小、能有效縮短收獲時(shí)間并較快的擴(kuò)增足量的BMSCs。BMSCs細(xì)胞替代治療方面擁有廣闊的應(yīng)用前景，研究中所用的這種改進(jìn)分離培養(yǎng)方法，為BMSCs的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用奠定一定方法學(xué)基礎(chǔ)。