杜忠禮，房忠菊，劉業(yè)海，朱玉華，陳立偉，孔欣茹，范俊達(dá)，任 楠，徐 偉，劉明波

1北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學(xué)中心，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，北京100730；2濰坊醫(yī)學(xué)院 研究生院耳鼻咽喉教研室，山東濰坊 261053；3安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，安徽合肥 230022；4解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100853；5解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院 耳鼻喉頭頸外科，海南三亞 572013；6山東大學(xué)附屬省耳鼻喉醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，山東濟(jì)南 250021

手術(shù)、放療和化療是喉鱗狀細(xì)胞癌臨床治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，并且有一定的療效，但中晚期喉癌患者預(yù)后仍然較差，研究顯示晚期喉鱗狀細(xì)胞癌患者5年生存率約為60%[1]。國內(nèi)外學(xué)者正在積極探索晚期癌癥患者治療的靶基因或下游信號(hào)通路突變基因，如表皮生長因子受體、NOTCH2通路[2-4]。生物標(biāo)志物對(duì)腫瘤治療和預(yù)后具有重要意義，但目前仍然沒有喉鱗狀細(xì)胞癌的敏感生物標(biāo)志物。LncRNA是由人類70% ～ 90%基因組編碼的一種長度超過200個(gè)核苷酸的RNA分子[5]。LncRNA參與許多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞代謝、免疫應(yīng)答、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、mRNA加工和降解以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種調(diào)控[6-7]。LncRNA的異常表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌[8]、多發(fā)性骨髓瘤[9]、肝癌[10]患者的生存均有顯著影響。研究顯示lncRNA與喉鱗狀細(xì)胞癌患者的生存密切相關(guān)[11]。本課題組前期已對(duì)中國人群喉鱗狀細(xì)胞癌患者進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)遺傳易感基因位點(diǎn)[12]。本研究繼續(xù)對(duì)前期研究中的喉鱗狀細(xì)胞癌患者進(jìn)行生存隨訪，并在獨(dú)立樣本中驗(yàn)證，以鑒定出與喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后相關(guān)的lncRNA基因的多態(tài)位點(diǎn)。

資料和方法

1 資料 本研究分為兩個(gè)階段，為全基因組關(guān)聯(lián)分析階段和驗(yàn)證階段，共635例患者。第一階段為關(guān)聯(lián)分析階段，研究對(duì)象為2000年1月- 2012年12月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院就診的喉鱗狀細(xì)胞癌易感性全基因組關(guān)聯(lián)研究的98例患者[12]；第二階段是驗(yàn)證階段，研究對(duì)象為2009年1月-2018年3月在解放軍總醫(yī)院、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和山東大學(xué)附屬耳鼻喉醫(yī)院就診的537例喉鱗狀細(xì)胞癌患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：1)民族為漢族；2)接受全喉切除術(shù)或喉部分切除術(shù)；3)經(jīng)病理組織學(xué)確診；4)隨訪生存資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)既往有其他癌癥病史或術(shù)前有抗癌治療；2)術(shù)后不到1個(gè)月死亡；3)SNP分型信息缺失。收集患者的年齡、性別、吸煙、飲酒和腫瘤分期等臨床資料。本研究獲得解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：301HNFY倫審第16號(hào))。

2 SNP篩選與分型 術(shù)前每例患者抽取3 ml外周靜脈血，采用酚-氯仿法提取基因組DNA，用于多態(tài)位點(diǎn)的基因分型。全基因組關(guān)聯(lián)分析階段的SNP篩選：芯片SNP分型數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控后有15 231個(gè)SNP位于lncRNA基因區(qū)域[12]，初步選取生存關(guān)聯(lián)分析后與喉癌患者總生存顯著相關(guān)的717個(gè)SNP(P值范圍為1.08×10-4～ 0.005)。驗(yàn)證階段的標(biāo)簽SNP篩選：對(duì)全基因組關(guān)聯(lián)分析階段初步選取的717個(gè)標(biāo)簽SNP進(jìn)行再次篩選，篩選步驟如下：1)篩選次要等位基因頻率≥0.05的SNP；2)采用單體型域的方法進(jìn)行連鎖不平衡分析，樣本量大小的膨脹因子r2＞0.8，選擇每個(gè)單體型域中P值最小的SNP。最終篩選出57個(gè)SNP在驗(yàn)證階段進(jìn)行驗(yàn)證。SNP分型：1)全基因組關(guān)聯(lián)分析階段的樣本基因分型采用Affymetrix GeneChip Human Mapping 6.0芯片分型數(shù)據(jù)；2)驗(yàn)證階段的樣本基因分型采用Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)。

3 生存隨訪及分析 生存相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析是團(tuán)隊(duì)前期對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌全基因組關(guān)聯(lián)研究的延伸。首先由訓(xùn)練有素的研究人員通過醫(yī)療記錄和電話信函方式獲得隨訪信息，隨訪的內(nèi)容包括患者的生存狀態(tài)、死亡時(shí)間及死亡原因等。隨訪截止時(shí)間為2018年3月24日，635例患者獲得完整生存隨訪數(shù)據(jù)。患者的總生存時(shí)間為手術(shù)日期至死亡日期或末次隨訪日期。隨訪截止時(shí)存活患者的生存數(shù)據(jù)為截尾數(shù)據(jù)。比較攜帶不同SNP基因型患者總生存的差異，運(yùn)用顯性模型、隱性模型和加性模型分別探討SNP與總生存的關(guān)系。

表1 喉鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床特征和生存情況Tab. 1 Clinical characteristics and survival of LSCC patients (n)

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0版軟件(SPSS，Chicago，IL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析SNP的Hardy-Weinberg平衡。繪制Kaplan-Meier生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)。通過多因素Cox回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型計(jì)算死亡風(fēng)險(xiǎn)比(HR)及其95%CI。Haploview軟件(v4.4)分析同一條染色體上SNP之間的連鎖不平衡。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

1 喉鱗狀細(xì)胞癌臨床特征和生存情況 全基因組關(guān)聯(lián)分析階段的98例患者的中位隨訪時(shí)間為65個(gè)月(3 ～ 113個(gè)月)，驗(yàn)證階段537例患者的中位隨訪時(shí)間為70個(gè)月(1 ～ 115個(gè)月)。全基因組關(guān)聯(lián)分析階段49例(50.0%)死亡，驗(yàn)證階段165例(30.7%)死亡。635例中按照喉癌UICC分期，0期14例，Ⅰ期51例，Ⅱ期128例，Ⅲ期223例，Ⅳ期 219 例 (表 1)。

2 與喉鱗狀細(xì)胞癌患者總生存相關(guān)的基因多態(tài)位點(diǎn) 研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼基因LINC00908中的rs17059513(log-rank檢驗(yàn)P=0.001)、LINC01813中的rs10208830(log-rank檢驗(yàn)P=0.023)和LINC01185中的rs2901182(log-rank檢驗(yàn)P=0.012)均與喉鱗狀細(xì)胞癌患者總生存顯著相關(guān)。校正年齡和腫瘤分期后，攜帶rs17059513 AG基因型患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著高于攜帶rs17059513 AA基因型患者，多因素Cox回歸結(jié)果顯示HR(95%CI)為2.23(1.46 ～3.39)；攜帶rs290118CT基因型患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著高于攜帶rs290118CC基因型患者，多因素Cox回歸結(jié)果顯示HR(95%CI)為2.10(1.11 ～ 4.00)；攜帶rs10208830 CC基因型患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著低于攜帶rs10208830 GG基因型患者，多因素Cox回歸結(jié)果顯示HR(95%CI)為 0.75(0.61 ～ 0.92)。校正年齡和腫瘤分期后，多因素Cox回歸加性模型分析顯示rs17059513和rs10208830的HR(95%CI)分別為 1.95(1.34 ～ 2.83)和 0.77(0.63 ～ 0.93)；顯性模型分析顯示rs17059513和rs10208830均與患者總生存顯著相關(guān)(log-rank檢驗(yàn)P值分別為1.81×10-4和0.037)(圖1A，圖1B)，多因素Cox回歸結(jié)果顯示HR(95%CI)分別為 2.19(1.45 ～ 3.32)和 0.74(0.56 ～0.98)。隱性模型分析顯示rs10208830與患者總生存顯著相關(guān)(log-rank檢驗(yàn)P=0.015)(圖1C)，多因素Cox回歸結(jié)果顯示HR(95%CI)為1.59(1.10 ～2.30)。見表 2。

表2 三個(gè)基因位點(diǎn)與喉鱗狀細(xì)胞癌患者總生存的關(guān)聯(lián)分析Tab. 2 Associations of three loci with overall survival of LSCC patients

圖1 基于顯性模型分析rs17059513 (A)和rs10208830 (B)與喉鱗狀細(xì)胞癌患者總生存的相關(guān)性，基于隱性模型分析rs10208830 (C)與喉鱗狀細(xì)胞癌患者總生存的相關(guān)性Fig. 1 Associations of rs17059513 (A) and rs10208830 (B) with the overall survival of LSCC patients using dominant model, and association of rs10208830 (C) with the overall survival of LSCC patients using recessive model

圖2 風(fēng)險(xiǎn)等位基因 (A, B)和風(fēng)險(xiǎn)基因型(C, D)與喉鱗狀細(xì)胞癌患者總生存的相關(guān)性rs17059513 AG或GG基因型、rs10208830 GC或GG基因型和rs2901182 CT基因型是風(fēng)險(xiǎn)基因型。風(fēng)險(xiǎn)基因型數(shù)為3個(gè)位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)基因型數(shù)之和。rs17059513 G等位基因、rs10208830 G等位基因和rs2901182 T等位基因是風(fēng)險(xiǎn)等位基因。rs17059513 AG基因型、rs10208830 GC基因型和rs2901182 CT基因型均含有1個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因；rs17059513 GG基因型和rs10208830 GG基因型均含有2個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因。風(fēng)險(xiǎn)等位基因數(shù)為3個(gè)位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)等位基因數(shù)之和Fig. 2 Associations of risk alleles (A, B) and risk genotypes (C, D) with the overall survival of LSCC patients. The rs17059513 AG or GG genotype, the rs10208830 GC or GG genotype, and the rs2901182 CT genotype were considered as risk genotypes. The number of risk genotype was the sum of the risk genotypes in these three loci. The rs17059513 G allele, the rs10208830 G allele, and the rs2901182 T allele were considered as risk alleles. The rs17059513 AG genotype, the rs10208830 GC genotype, and the rs2901182 CT genotype contained one risk allele; while the rs17059513 GG genotype and the rs10208830 GG genotype contained two risk alleles. The number of risk alleles was the sum of risk alleles in these three loci

3 總生存相關(guān)的基因多態(tài)位點(diǎn)的累積分析 進(jìn)一步對(duì)3個(gè)SNP進(jìn)行累積分析，結(jié)果顯示隨著風(fēng)險(xiǎn)等位基因(圖2A，圖2B)或風(fēng)險(xiǎn)基因型(圖2C，圖2D)的增加，死亡風(fēng)險(xiǎn)比增加。攜帶3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)最高，HR為3.11(P=2.00×10-4)(圖2B)。攜帶2 ～ 3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因型的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)最高，HR為3.24(P=3.80×10-6)(圖2D)。

討 論

LncRNA最初被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”，但近年來研究發(fā)現(xiàn)其是癌癥發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子，廣泛參與腫瘤染色體的沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾等多種重要的調(diào)控過程，恰似一樞紐電路板以特有的內(nèi)在方式連接諸分子單元，并調(diào)控其“邏輯運(yùn)算”，調(diào)控靶基因的表達(dá)[13-16]。喉鱗狀細(xì)胞癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，lncRNA在喉癌中的異常表達(dá)可作為喉癌早期診斷及生存預(yù)后的標(biāo)志，以往的研究已經(jīng)報(bào)道一些喉癌的生物標(biāo)志物，如泛素交叉反應(yīng)蛋白(UCRP)[17]、尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)[18]、同源盒基因轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)[19]等。我們前期通過全基因組關(guān)聯(lián)研究確定了中國人群喉鱗狀細(xì)胞癌的遺傳易感基因位點(diǎn)，相關(guān)文章發(fā)表在Nature genetics[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，LINC00908基因的rs17059513、LINC01813基因的rs10208830和LINC01185基因的rs2901182與喉鱗狀細(xì)胞癌患者的總生存具有顯著相關(guān)性。

本研究是第一個(gè)關(guān)注喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存與lncRNA基因的多態(tài)位點(diǎn)相關(guān)性的研究。位于18q23號(hào)染色體的LINC00908基因內(nèi)含子區(qū)的rs17059513顯示出最顯著的差異。有研究顯示LINC00908可作為膠質(zhì)瘤潛在的預(yù)后標(biāo)志物[20]，但關(guān)于LINC00908功能的報(bào)道卻很少。已有研究顯示腫瘤代謝可以由lncRNA外顯子的兩個(gè)不同的等位基因進(jìn)行特異性調(diào)節(jié)[21]。而本研究中發(fā)現(xiàn)的rs17059513的不同等位基因也可能通過某種未知的機(jī)制影響LINC00908的表達(dá)從而影響預(yù)后，所以需要進(jìn)一步的研究來闡明該位點(diǎn)的功能。

rs10208830和rs2901182分別位于染色體2p16.1的LINC01813和LINC01185基因內(nèi)含子區(qū)。有研究顯示LINC01185所在的染色體2 p16.1區(qū)域與銀屑病相關(guān)[22]。但迄今為止，對(duì)LINC01813和LINC01185功能的研究較少。本研究確定的3個(gè)位點(diǎn)對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后具有累積效應(yīng)。攜帶多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因型或風(fēng)險(xiǎn)等位基因的患者較攜帶單個(gè)變異的患者有更差的預(yù)后。該結(jié)果提示發(fā)現(xiàn)與預(yù)后相關(guān)的基因位點(diǎn)，可借助其區(qū)分不同的預(yù)后人群，此可能成為預(yù)測(cè)喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。