盛 煒，張 麗，李美蓉，付小兵

1解放軍總醫(yī)院 醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究部創(chuàng)面治療中心，北京 100853；2解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京 100853；3解放軍總醫(yī)院 醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究部創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生研究中心，北京 100853

慢性創(chuàng)面治療是創(chuàng)傷研究領(lǐng)域的難題[1]。體外沖擊波療法(extracorporeal shock wave therapy，ESWT)作為能量醫(yī)學(xué)和物理醫(yī)學(xué)相結(jié)合的新型治療方法，具有安全、無創(chuàng)、有效的特點(diǎn)，其不僅在難愈性骨折、肌腱末端病等肌骨疾病的治療中廣泛應(yīng)用[2-4]，在創(chuàng)面修復(fù)，包括急、慢性創(chuàng)面的臨床治療中亦顯示出獨(dú)特優(yōu)勢。多個研究團(tuán)隊均證實ESWT可促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面、血管病變相關(guān)創(chuàng)面等多種慢性創(chuàng)面愈合，初步表明ESWT治療慢性創(chuàng)面的有效性和安全性[5-10]。2017年底，美國FDA批準(zhǔn)ESWT用于糖尿病慢性創(chuàng)面的臨床治療，標(biāo)志著ESWT已經(jīng)正式成為慢性創(chuàng)面的臨床治療手段，同時也進(jìn)一步顯示了ESWT的應(yīng)用前景和研究潛力[11-12]。深入地探討ESWT的作用機(jī)制，一方面將為ESWT在臨床的應(yīng)用提供理論依據(jù)；另一方面將為深入認(rèn)識ESWT的作用機(jī)制提供新的研究方向和靶點(diǎn)，而目前對ESWT促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的主要作用機(jī)制及信號傳導(dǎo)通路尚不清楚，現(xiàn)將相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 沖擊波的概念及物理特性

沖擊波(shock wave，SW)是一種通過振動或者高速運(yùn)動導(dǎo)致介質(zhì)極速壓縮、聚集而產(chǎn)生的機(jī)械能量波[13-14]。沖擊波能量具有方向性，能在極短的時間內(nèi)(＜10 ns)釋放較強(qiáng)的峰值壓力(可高達(dá)100 MPa)，在介質(zhì)中傳播時可引起介質(zhì)的壓強(qiáng)、溫度、密度等物理性質(zhì)發(fā)生顯著的、跳躍式的改變，從而產(chǎn)生一系列物理學(xué)效應(yīng)。1)機(jī)械效應(yīng)：沖擊波在不同介質(zhì)的交界處加壓和撤壓而產(chǎn)生的牽張效應(yīng)；2)空化效應(yīng)：當(dāng)沖擊波強(qiáng)度超過一定值時，存在于介質(zhì)中的微氣核空化泡振動進(jìn)而發(fā)生牽伸和崩潰所產(chǎn)生的效應(yīng)；3)熱效應(yīng)：沖擊波在生物體內(nèi)傳播過程中，其振動能量被組織吸收而轉(zhuǎn)化為熱量的效應(yīng)[13,15-16]。

2 ESWT生物學(xué)效應(yīng)的啟動機(jī)制與機(jī)械敏感性離子通道

作為一種機(jī)械能量，沖擊波是如何在生物體的組織或細(xì)胞內(nèi)由機(jī)械力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信號，進(jìn)而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的呢？這是探索ESWT作用機(jī)制的根本性問題。

已經(jīng)證實，機(jī)體細(xì)胞能夠感受細(xì)胞外環(huán)境中的機(jī)械應(yīng)力刺激，主要是因為其細(xì)胞膜上存在著特異性機(jī)械敏感性離子通道(mechanosensitive ion channel，MSIC)。MSIC是一類感受細(xì)胞膜表面應(yīng)力變化，實現(xiàn)細(xì)胞外機(jī)械信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的離子通道，根據(jù)通透性分為離子選擇性和非離子選擇性通道，根據(jù)功能作用分為張力激活型和張力失活型離子通道[17]。當(dāng)沖擊波的機(jī)械應(yīng)力刺激細(xì)胞時，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生彈性形變，激活細(xì)胞膜上的MSIC蛋白，從而產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。目前，研究已經(jīng)證實MSIC主要有以下通道蛋白：Pannexin蛋白通道、Piezo非選擇性陽離子通道(Piezo1蛋白離子通道和Piezo2蛋白離子通道)、退行性蛋白離子通道(DEG)/上皮鈉通道離子通道(ENaC)/酸度激活性離子通道(ASIC)、瞬時電位感受性離子通道通道(TRP)以及雙孔鉀通道(K2P)等。

2.1 Pannexin蛋白通道 Pannexin蛋白廣泛存在于骨與軟骨、皮膚、肌肉等多種器官和組織的細(xì)胞中，是構(gòu)成細(xì)胞間隙連接(gap junction，GJ)的重要結(jié)構(gòu)，其家族包括Pannexin1、Pannexin2和Pannexin3，其中Pannexin1(Panx1)蛋白可以特異性感應(yīng)機(jī)械應(yīng)力刺激[18-20]。Panx1蛋白結(jié)構(gòu)包括4個跨膜結(jié)構(gòu)域、2個細(xì)胞內(nèi)氨基端、2個細(xì)胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)、2個羧基端(圖1)[20-21]。常規(guī)情況下，Panx1蛋白以封閉式的半通道存在；在機(jī)械能量刺激下，細(xì)胞膜上的Panx1蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成開放性GJ通道，使離子和大分子物質(zhì)如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)得以跨膜運(yùn)動[21]。研究顯示，ESWT機(jī)械能量可刺激MSCs、ASCs以及T細(xì)胞等多種細(xì)胞的細(xì)胞膜Panx1蛋白，引起胞內(nèi)ATP的外向釋放，當(dāng)細(xì)胞外ATP濃度達(dá)到1.0 ～ 6.9μmol/L時，就足以激活細(xì)胞膜上的P2X7受體[22-23]，提示ESWT刺激細(xì)胞膜Panx1蛋白進(jìn)而促使胞內(nèi)ATP的外向釋放，是ESWT生物學(xué)效應(yīng)的啟動機(jī)制和重要環(huán)節(jié)[22-23]。

圖1 Pannexin蛋白結(jié)構(gòu)及通道示意圖Fig. 1 Schematic diagram of Pannexin protein structure and channels

2.2 Pizeo蛋白通道 在脊椎動物中存在兩種類型的Piezo蛋白，即Piezo1蛋白和Piezo2蛋白[24]。Piezo1蛋白由FAM38A基因編碼，由2 500個氨基酸構(gòu)成，擁有24 ～ 40個跨膜結(jié)構(gòu)域，是一種巨大的跨膜蛋白，廣泛分布于皮膚、內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、膀胱、肺等真核細(xì)胞中。Piezo1通道呈現(xiàn)三聚體三葉螺旋槳狀結(jié)構(gòu)(圖2)，其中心為控制離子通透的孔道部分[25]。不同于其他離子通道類型，Piezo1通道的跨膜區(qū)以大曲度、而非平面形式存在，這可能是Piezo通道能有效感知細(xì)胞膜機(jī)械應(yīng)力變化的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一[26]。研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1通道可以非選擇性通過Ca2+、Mg2+、Mn2+等二價離子以及K+、Na+等一價堿性離子。Piezo1通道是與細(xì)胞骨架的整合素蛋白密切相關(guān)，可以由整合素的結(jié)構(gòu)改變造成離子通道的開放和關(guān)閉。Piezo1蛋白通道在機(jī)械應(yīng)力刺激下可增加細(xì)胞質(zhì)中Ca2+以及谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的活性，以Ca2+離子作為機(jī)械信息的第二信使，參與細(xì)胞的黏附與遷移功能調(diào)節(jié)[27]。Piezo2蛋白由2 800個氨基酸構(gòu)成，由FAM38B基因進(jìn)行編碼，主要分布于三叉神經(jīng)感覺細(xì)胞、背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、Merkel細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)對機(jī)械刺激所介導(dǎo)的感覺功能以及炎性介質(zhì)的釋放與表達(dá)[27-28]。

2.3 退行性蛋白通道(DEG)/上皮鈉離子通道(ENaC)/酸度激活性離子通道(ASIC) DEG/ENaC通道有2個跨膜序列和1個大型的富含半胱氨酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)延伸到細(xì)胞外，在細(xì)胞內(nèi)有相對較短的氨基末端/羧基末端。研究表明，ENaC可能通過位置蛋白磷酸化來調(diào)節(jié)骨細(xì)胞生長，但其具體機(jī)制尚不明確。當(dāng)細(xì)胞受到機(jī)械應(yīng)力刺激時候可引起整合素-細(xì)胞骨架復(fù)合體的構(gòu)象變化，改變MSIC，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高，觸動酪氨酸激酶磷酸化，從而激活第二信使系統(tǒng)，啟動應(yīng)力反應(yīng)元件(stress responsive element，SRE)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、代謝和凋亡。

2.4 瞬時電位感受性(TRP)通道 TRP通道包括6個跨膜功能區(qū)，被證明是一種滲透壓感受器，在炎癥過程中，可以使痛覺神經(jīng)元對滲透壓及機(jī)械刺激產(chǎn)生痛覺過敏。

2.5 雙孔鉀(K2P)通道 K2P離子通道具有4個跨膜功能區(qū)和2個前后排列的孔道，可分成TWIK、TASK、TREK和TRAAK四個亞型，其中TREK-1、TREK-2和TRAAK均是與機(jī)械應(yīng)力信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的離子通路。研究表明K2P通道可以改變細(xì)胞的微絲微管等細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，而TREK-1多位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。

3 ESWT生物學(xué)效應(yīng)的信號通路研究

ATP不僅是細(xì)胞內(nèi)的重要能量物質(zhì)，而且還可以作為一種自分泌或旁分泌的生物學(xué)信號，調(diào)節(jié)細(xì)胞的病理生理功能。常規(guī)情況下，細(xì)胞外ATP濃度維持在極低水平，當(dāng)其濃度升高到一定水平(0.1 ～ 1μmol/L)時，就可結(jié)合并激活細(xì)胞膜上的特異性2型嘌呤信號(type 2 puriengic signaling，P2)受體[18,29]。P2受體主要包括P2X和P2Y兩大家族，其中P2X受體是一種配體門控離子通道，有7個亞型。Minns等[30]觀察到，在上皮細(xì)胞的增殖過程中，P2X7受體的表達(dá)增加。細(xì)胞外的ATP主要結(jié)合并激活細(xì)胞膜P2X7受體，使細(xì)胞內(nèi)MAPK激酶(MAPKK)磷酸化，從而活化MAPK信號通路。進(jìn)一步的反向驗證實驗顯示，當(dāng)分別應(yīng)用Panx1蛋白抑制劑、P2X7受體抑制劑或者ATP水解酶干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)的MAPK激酶乃至整個MAPK信號通路的活化都會受到抑制，同時MSCs、ASCs以及T細(xì)胞的增殖和分化過程也會受到抑制，進(jìn)一步佐證了Panx1蛋白、ATP外向釋放以及后繼的P2X7受體激活是ESWT在多種細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵信號通路[18,22-23]。

有絲分裂源活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是廣泛存在于真核細(xì)胞和原核細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)重要的凋亡與分化的信號通路，介導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化、組織修復(fù)等生、病理過程[19,31]。ATP的外向釋放和P2X7受體的激活可使細(xì)胞內(nèi)的MAPKK磷酸化，進(jìn)而激活MAPK信號通路[22-23]。MAPK信號通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)、c-Jun N 端 激 酶 (Jun-N terminal kinase，JNK)信號通路、p38 MAPK三條通路，是細(xì)胞外信號引起細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞功能活動的重要樞紐，在多種細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞間的功能協(xié)調(diào)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。MAPK活性通路降低時，細(xì)胞自我更新能力下降、增殖潛能喪失。研究顯示，MAPK信號通路存在不同程度的功能障礙，是慢性創(chuàng)面的發(fā)生機(jī)制之一[32]。

在MAPK信號通路中，ERK1/2是一種典型的MAPK通路，只能接受其上游細(xì)胞外的信號調(diào)節(jié)激酶的調(diào)節(jié)。有研究表明，MAPK/ERK1/2可以被體外機(jī)械應(yīng)力所激活，而且呈現(xiàn)出時間依賴性和強(qiáng)度依賴性等特征；而ERK5是一種非典型的MAPK通路，有研究報道MAPK/ERK5可以被體外機(jī)械應(yīng)力刺激直接激活。在血管內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞的研究中，已經(jīng)證實了體外機(jī)械應(yīng)力對MAPK/ERK5的激活作用。據(jù)此，可以推測MAPK/ERK5可能是機(jī)械敏感性離子通道所介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的下游信號分子。

圖2 Piezo1通道的三聚體冷凍電鏡示意圖Fig. 2 Achematic diagram of the trimer cryo-EM of Piezo1 channel

另外，MAPK信號通路在ESWT促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖和分化過程中具有關(guān)鍵作用。侯向鋒等[22]發(fā)現(xiàn)低能量沖擊波可刺激MSCs內(nèi)p38MAPK激酶磷酸化，且磷酸化程度與沖擊波治療劑量呈正相關(guān)關(guān)系，提示ESWT可能通過p38MAPK激酶激活MAPK信號通路，進(jìn)而促進(jìn)MSCs增殖并向成骨細(xì)胞分化；凌琳[33]采用低能量沖擊波刺激兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，其再生能力增強(qiáng)，同時ERK、JNK蛋白表達(dá)水平也在ESWT干預(yù)后顯著升高，提示ESWT可能是通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)MAPK信號通路蛋白ERK、JNK蛋白的表達(dá)而實現(xiàn)的；Weihs等[23]應(yīng)用中-低能量沖擊波(能量密度：0.03 ～ 0.19 mJ/mm2)分別刺激小鼠MSCs、人ASCs以及T細(xì)胞三種不同類型的細(xì)胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種細(xì)胞的增殖能力均明顯增強(qiáng)，其細(xì)胞代謝水平增加，同時發(fā)現(xiàn)嘌呤信號誘導(dǎo)的ERK MAPK和p38 MAPK激酶在沖擊波作用后快速活化，且其活化程度均與沖擊波能量呈正向劑量-效應(yīng)關(guān)系，由此進(jìn)一步佐證了MAPK信號通路調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和分化功能可能是ESWT促進(jìn)組織修復(fù)的重要效應(yīng)途徑(圖3)。

4 ESWT促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合的細(xì)胞學(xué)研究

目前，ESWT對機(jī)體的生物學(xué)效應(yīng)主要包括誘導(dǎo)細(xì)胞或干細(xì)胞的增殖和多向分化、促進(jìn)新生血管形成以及循環(huán)改善、調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)以及緩解疼痛等[7,34]。組織修復(fù)細(xì)胞對創(chuàng)面愈合起著決定性的作用。有效激活創(chuàng)面局部修復(fù)細(xì)胞的增殖、分化和遷移，對于加速慢性創(chuàng)面的愈合具有積極作用和重大意義。

研究發(fā)現(xiàn)，ESWT所攜帶的機(jī)械性能量刺激能夠誘導(dǎo)組織修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞——成纖維細(xì)胞的增殖以及干細(xì)胞的多向分化：成纖維細(xì)胞是一種機(jī)械敏感性細(xì)胞，ESWT機(jī)械能量刺激可以通過細(xì)胞的機(jī)械信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能[35-36]。Berta等[37]采用ESWT體外刺激成纖維細(xì)胞后，ESWT刺激組成纖維細(xì)胞的增殖效率明顯提高，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)及Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)也顯著高于對照組，提示創(chuàng)面局部及周圍組織的成纖維細(xì)胞的功能被ESWT所激活；Cai等[38]發(fā)現(xiàn)ESWT刺激成纖維細(xì)胞后，其細(xì)胞因子IL-6和IL-8表達(dá)水平升高，而TNF-α表達(dá)水平下降；動物水平的缺血性皮瓣移植創(chuàng)面，在ESWT干預(yù)后，皮瓣缺血性壞死面積明顯減少，細(xì)胞凋亡比例降低，創(chuàng)面組織中成纖維細(xì)胞數(shù)量增加，增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶以及脯氨酸羥化酶(proline hydroxylase，RPH)的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而CD45、活性氧自由基，如8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxyguanosine，8-OG)、H2O2的表達(dá)也顯著減少，提示ESWT的作用機(jī)制涉及氧自由基代謝、炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)以及皮膚成纖維細(xì)胞募集等，從而在缺血性慢性創(chuàng)面的治療中發(fā)揮積極作用[39]；Aschermann等[40]在下肢慢性創(chuàng)面的研究中發(fā)現(xiàn)，ESWT可刺激細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，加速角質(zhì)細(xì)胞遷移；細(xì)胞增殖周期調(diào)控基因表達(dá)上調(diào)，成纖維細(xì)胞增殖加快；同時伴隨著炎性細(xì)胞因子分泌及新生血管的形成。Hausdorf等[41]發(fā)現(xiàn)人成纖維細(xì)胞經(jīng)ESWT刺激后，F(xiàn)GF-2和TGF-β水平顯著升高(P＜0.05)，提示ESWT能夠促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)的生長因子合成和(或)釋放。

圖3 Panx1蛋白-ATP釋放-MAPK信號通路與ESWT作用機(jī)制Fig. 3 Panx1 protein-ATP release-MAPK signaling pathway and ESWT mechanism

在干細(xì)胞領(lǐng)域，ESWT能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)、肌腱來源的干細(xì)胞/祖細(xì)胞(tendon-derived stem/progenitor cells，TSPCs)、脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ASCs)等多種來源干細(xì)胞的增殖和多向分化。Leone等[35]發(fā)現(xiàn)，在離體狀態(tài)下，ESWT可刺激TSPCs增殖和分化加速；李眾利等發(fā)現(xiàn)，ESWT不僅能促進(jìn)MSCs的增殖和成骨分化能力，而且還可刺激MSCs分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和 CXC 趨化因子配體(CXC ligand，CXCL)，促進(jìn)新生血管形成和神經(jīng)再生[42-43]；此外，ESWT還能顯著提高ASCs的增殖能力，同時刺激其向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的多向分化能力[2,44]。

綜上，現(xiàn)有研究證據(jù)表明，細(xì)胞膜上的機(jī)械信號敏感性感應(yīng)蛋白及離子通道激活可能是ESWT的重要作用靶點(diǎn)和啟動機(jī)制，而MAPK信號通路可能是機(jī)械敏感性離子通道所介導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)的下游信號分子。修復(fù)細(xì)胞在機(jī)械能量的刺激下，其增殖、分化和遷移活性發(fā)生改變是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。但更為具體的效應(yīng)機(jī)制有待于更為深入的基礎(chǔ)研究和證據(jù)支持。