田玉生，鄒顏陽

(重慶醫(yī)科大學附屬南川人民醫(yī)院，重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院病理科，重慶 408400)

結腸癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率居全球第3位。有研究[1]報道，結腸癌患者5年生存率僅約50%。盡管近年來外科手術和放化療技術取得了很大進展，但是結腸癌患者的死亡率仍居高不下，特別是晚期患者。因此亟需找到用于早期診斷和治療的新型分子標志物，以提高結腸癌患者的生存率。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種長度大于200個核苷酸、但不具備編碼蛋白能力的基因轉錄產物。越來越多的研究[2]發(fā)現(xiàn)，lncRNA與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。FAM83H-AS1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型lncRNA，與多種腫瘤有關，如肝細胞癌[3]、胃癌[4]和膀胱癌[5]等。YANG等[6]通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83H-AS1在結腸癌患者組織中高表達。為進一步分析FAM83H-AS1在結腸癌組織中異常表達的臨床意義，本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)和原位雜交法檢測了結腸癌組織中FAM83H-AS1的表達水平，并探討了其與患者臨床特征及預后的關系?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

納入標準：1)經病理檢查證實為結腸癌者；2)術前未接受放療、化療或免疫治療者；3)病例資料完整者；4)家屬知情同意者。排除標準：1)伴有其他部位惡性腫瘤者；2)嚴重的心、肝、腎等臟器功能障礙者；3)伴免疫系統(tǒng)疾病者。

收集2012年6月至2013年6月在重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院進行手術治療的結腸癌患者90例，術中留存90例結腸癌(結腸癌組)及對應的癌旁組織(癌旁組)標本，癌旁組織距離腫瘤邊緣≥5 cm，術后病理檢查證實無癌組織侵犯[7]?；颊吣挲g48～87歲，平均(67.25±8.29)歲；男49例，女41例；腫瘤直徑≤5 cm者40例，>5 cm者50例；左側結腸51例，右側結腸癌39例；低分化癌26例，中/高分化癌64例；浸潤深度T1/T2 30例，T3/T4 60例；有淋巴結轉移9例；TNM分期為Ⅰ期8例，Ⅱ期45例，Ⅲ期20例，Ⅳ期17例。隨訪終點為患者死亡或2019年5月，隨訪時間為2～83個月，平均(55.01±26.93)個月。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)；2×SYBR Green PCR Master Mix試劑(美國Invitrogen公司)；原位雜交用預雜交液和封閉液(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；Anti-Digoxigenin-POD試劑和地高辛標記探針檢測試劑盒(美國羅氏公司)。

1.3 RT-qPCR檢測FAM83H-AS1的mRNA表達

用RNA提取試劑盒提取總RNA，將RNA逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，用2×SYBR Green PCR Master Mix進行RT-qPCR，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。本研究以18S rRNA為內參。用2-△△Ct法計算組織中FAM83H-AS1 mRNA表達水平。引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設計并合成，F(xiàn)AM83H-AS1和18S rRNA引物序列見表1。

表1 FAM83H-AS1和18S rRNA基因的引物序列

1.4 原位雜交法檢測FAM83H-AS1表達水平

組織標本4 mm切片后，常規(guī)脫蠟脫水。將探針FAM83H-AS1用雜交液稀釋至20 nmol·L-1，滴加于組織切片上，水浴鍋中雜交18 h，隨后用TI-KS溶液洗滌3次，含牛血清白蛋白封閉液封閉25 min。雜交后用Anti-Digoxigenin-POD檢測地高辛探針與FAM83H-AS1結合復合物，TSA放大系統(tǒng)(北京普華量宇科技有限公司)增強原位雜交反應信號，NBT/BCIP顯色，最后用中性樹膠封片。染色結果由兩專業(yè)人士獨立進行雙盲評分：染色強度評分：0分(無染色)，1分(淺黃色染色)，2分(棕色染色)，3分(深棕色染色)。陽性細胞數(shù)計分：0(<5%染色細胞)、1(5%～25%染色細胞)、2(25%～50%染色細胞)、3(50%～75%染色細胞)和4(>75%染色細胞)。FAM83H-AS1的表達水平為陽性細胞數(shù)計分乘以染色強度評分[8]，0表示陰性(-)，1～3表示弱陽性(+)，4～8表示陽性()，9～12表示強陽性()。以0～3分為低表達；4～6分為高表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)計量數(shù)據(jù)采用(均數(shù)±標準差)表示，組間比較用t檢驗；計數(shù)資料采用百分率(%))表示，組間比較用χ2檢驗，等級資料采用非參數(shù)秩和檢驗；用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率比較采用log-rank檢驗；采用COX多因素回歸分析FAM83H-AS1表達與結腸癌患者臨床特征及總體生存率的關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組FAM83H-AS1的表達

RT-qPCR檢測結果顯示，結腸癌組FAM83H-AS1mRNA的相對表達量為(4.48±1.38)，明顯高于癌旁組(1.18±0.24)，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=22.350，P<0.001)。見圖1。原位雜交法檢測結果顯示，F(xiàn)AM83H-AS1主要表達于細胞核，在細胞漿中也有表達(圖2)，而且結腸癌組大多呈強陽性表達；與RT-qPCR檢測結果一致，結腸癌組FAM83H-AS1的陽性表達率明顯高于癌旁組(Z=-7.645，P<0.001)。見表2。

表2 2組FAM83H-AS1表達的比較 例

2.2 FAM83H-AS1表達與結腸癌患者臨床特征的關系

Spearman相關性分析顯示，F(xiàn)AM83H-AS1表達水平與結腸癌組織的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期呈正相關(r=0.342、0.376、0.410、0.612，P<0.05)。見表3。COX多因素回歸分析結果顯示，分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期是影響結腸癌中FAM83H-AS1表達的獨立因素(P<0.05)。見表4。

表3 FAM83H-AS1表達與結腸癌患者臨床特征的關系

表4 COX多因素回歸分析FAM83H-AS1表達與結腸癌患者臨床特征的關系

2.3 FAM83H-AS1表達與結腸癌患者預后的關系

Kaplan-Meier生存分析結果顯示，F(xiàn)AM83H-AS1高表達的結腸癌患者的5年生存率為26.85%，明顯低于低表達患者(80.36%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3。COX多因素回歸分析結果顯示，年齡、FAM83H-AS1表達水平、浸潤深度和淋巴結轉移是影響結腸癌患者總體生存率的獨立因素(P<0.05)，且年齡越高、FAM83H-AS1表達水平越高、腫瘤浸潤越深和淋巴結越易發(fā)生轉移，患者總體生存率越低。見表5。

表5 FAM83H-AS1表達與結腸癌患者總體生存率的關系

3 討論

結腸癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，確診時多數(shù)患者已為進展期，預后較差[1]。因此尋找潛在的分子生物學標志物來提高結腸癌患者的診斷有著重要意義。近年，lncRNA對腫瘤診斷和治療的價值引起了國內外學者的重視。其中，F(xiàn)AM83H-AS1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型lncRNA，與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關[3-5,9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83H-AS1在結腸癌組織中的表達水平較癌旁組織更高，這與YANG等[6]報道一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83H-AS1的表達水平與結腸癌組織的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期有關，提示FAM83H-AS1與結腸癌的進展密切相關。在其他腫瘤組織中已有類似報道。例如，在卵巢癌的研究中，DOU等[10]發(fā)現(xiàn)FAM83H-AS1可以促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲，并且其表達水平與卵巢癌大小、病理分期和淋巴結轉移有關。但是，與本研究結果不同的是，YANG等[11]發(fā)現(xiàn)FAM83H-AS1表達水平與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移和TNM分期均無關。這些研究結果的差異性可能與組織樣本量、腫瘤的類型和患者的年齡等因素有關，需要今后進一步分析。

有研究[12-13]報道，年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移和TNM分期等與結腸癌患者預后有關。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83H-AS1異常高表達與結腸癌患者的不良預后有關。FAM83H-AS1高表達的結腸癌患者的總體生存率為26.85%，明顯低于低表達水平患者(80.36%)。另外多因素分析結果也顯示，F(xiàn)AM83H-AS1高表達是結腸癌患者不良預后的獨立因素。本研究結果與既往大多數(shù)研究[4,11]一致，例如DA等[4]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83H-AS1高表達與胃癌患者的總體生存率和中位生存時間低有關。YANG等[11]也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83H-AS1高表達的患者生存率明顯低于低表達患者。

有研究[14]顯示，F(xiàn)AM83H-AS1可能通過靶向Notch信號通路促進結直腸癌細胞的增殖。FAM83H-AS1的致癌作用也可能與MET/EGFR信號通路、E6-p300信號通路和MYC信號通路等有關[15-17]。FAM83H-AS1在結腸癌中通過何種機制發(fā)揮其促癌，需要更進一步的研究。

綜上所述，本研究結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83H-AS1在結腸癌組織中呈異常高表達，其表達水平與癌組織的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期和生存預后有關，而且是這些臨床參數(shù)的獨立影響因素。這些結果表明FAM83H-AS1可能在結腸癌的發(fā)生和發(fā)展中起著致癌作用。但FAM83H-AS1如何促進結腸癌發(fā)生發(fā)展，至今尚未明確，這可能是未來進一步研究的方向。