李 敏，張春梅，榮 耕，王明明

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬江津中心醫(yī)院、重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院病理科，重慶 402260)

鋸齒狀腺瘤是導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生的重要因素[1]，其癌變的具體機(jī)制尚不明確，對(duì)其機(jī)制的深入研究具有重要臨床意義。microRNA是一種長(zhǎng)約22～24個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，具有多種生物學(xué)功能，其在腫瘤性疾病中的作用備受關(guān)注[2]，如miR-181c在前列腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤性疾病中表達(dá)異常[3-6]，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程具有重要意義；此外，miR-181c可通過調(diào)控線粒體相關(guān)基因mRNA影響線粒體功能而發(fā)揮作用[7]。線粒體自噬(mitophagy)是細(xì)胞清除損傷線粒體的一種途徑，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[8]。與線粒體自噬相關(guān)的PINK1、Parkin、Nix和Bnip3等重要分子，均為抑癌基因，這提示線粒體自噬在腫瘤性疾病中發(fā)揮著重要作用[9-10]。但miR-181c及線粒體自噬是否在鋸齒狀腺瘤癌變過程中發(fā)揮作用目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過比較正常結(jié)腸組織、鋸齒狀腺瘤組織及結(jié)直腸癌組織中miR-181c的表達(dá)變化情況及線粒體自噬的發(fā)生情況，明確miR-181c在鋸齒狀腺瘤癌變中的作用。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本來源

收集2015—2018年重慶醫(yī)科大學(xué)附屬江津中心醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)為鋸齒狀腺癌的病變標(biāo)本20例為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)收集經(jīng)病理證實(shí)為鋸齒狀腺瘤的病變標(biāo)本20例作為對(duì)照組，所有實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均經(jīng)患者知情同意。

1.2 細(xì)胞來源

細(xì)胞株：人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC細(xì)胞、人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞購(gòu)買于上海細(xì)胞研究所。

1.3 主要試劑和儀器

miScript Plant PT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒(中國(guó)TIANGEN公司)，PINK1(美國(guó)abcam公司，1:500稀釋)，TOM20(美國(guó)abcam公司，1:100稀釋)，HSP60(美國(guó)abcam公司，1:500稀釋)和GAPDH抗體(美國(guó)abcam公司，1:1000稀釋)。胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，lip2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)。ABI PRISM 7500定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)，奧德賽掃膜成像儀(美國(guó)Licor公司)。

1.4 Real-time PCR

CCL4法提取組織或細(xì)胞總RNA。應(yīng)用miScript Plant PT Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)反應(yīng)，2-△△Ct檢測(cè)miRNA表達(dá)變化情況。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，并將其分為2組：實(shí)驗(yàn)組(mimic-181c轉(zhuǎn)染組)和對(duì)照組(mimic-NC轉(zhuǎn)染組)。待細(xì)胞增長(zhǎng)至70%后，向?qū)嶒?yàn)組中轉(zhuǎn)染入mimic-181c，對(duì)照組中轉(zhuǎn)染入mimic-NC。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)4 h后更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后收集各自細(xì)胞進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn)；培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印記(Western Blot)實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western Blot檢測(cè)PINK1、TOM20和HSP60等蛋白表達(dá)水平

研磨組織并提取組織蛋白，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行預(yù)處理，配制蛋白電泳凝膠，對(duì)蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，PVDF膜在封閉液中封閉，加入一抗孵育，加入熒光二抗孵育，掃膜成像。利用Image-Pro Plus 6軟件，對(duì)Western blot圖像進(jìn)行灰度測(cè)定，計(jì)算各條帶與對(duì)應(yīng)的GAPDH的灰度比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-181c在鋸齒狀腺癌組織中表達(dá)減少

應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)所收集的鋸齒狀腺癌及鋸齒狀腺瘤組織中miR-181c的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miR-181c在鋸齒狀腺癌組織中表達(dá)水平明顯低于鋸齒狀腺瘤組織(P<0.05)，見圖1。

2.2 miR-181c在Caco-2細(xì)胞中表達(dá)減少

應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)體外培養(yǎng)的FHC細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞中miR-181c的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR-181c在Caco-2細(xì)胞中表達(dá)水平較FHC細(xì)胞中明顯降低(P<0.05)，見圖2。

2.3 鋸齒狀腺癌組織中線粒體自噬較鋸齒狀腺瘤組織發(fā)生減少

應(yīng)用Western Blot檢測(cè)鋸齒狀腺癌組織和鋸齒狀腺瘤組織中PINK1、TOM20和HSP60等蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與鋸齒狀腺瘤組織相比，鋸齒狀腺癌組織中TOM20、HSP60表達(dá)較高，但PINK1表達(dá)減少(P<0.05)，見圖3。

2.4 Caco-2細(xì)胞線粒體自噬發(fā)生較FHC細(xì)胞減少

應(yīng)用Western Blot檢測(cè)體外培養(yǎng)的FHC細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞中PINK1、TOM20和HSP60等蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與FHC細(xì)胞相比，Caco-2細(xì)胞中TOM20、HSP60表達(dá)較高，但PINK1表達(dá)減少(P<0.05)，見圖4。

2.5 成功上調(diào)Caco-2細(xì)胞中miR-181c的表達(dá)

體外培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞，并將其分為mimic-181c轉(zhuǎn)染組和mimic-NC轉(zhuǎn)染組，然后應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)2組細(xì)胞中mimic-181c表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與mimic-NC轉(zhuǎn)染組相比，mimic-181c轉(zhuǎn)染組中mimic-181c表達(dá)顯著升高(P<0.001)，見圖5。

2.6 上調(diào)細(xì)胞中miR-181c表達(dá)后可促進(jìn)線粒體自噬發(fā)生

體外培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞，并將其分為mimic-181c轉(zhuǎn)染組和mimic-NC轉(zhuǎn)染組，然后應(yīng)用Western Blot檢測(cè)2組細(xì)胞中PINK1、TOM20和HSP60等蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與mimic-NC轉(zhuǎn)染組相比，mimic-181c轉(zhuǎn)染組中TOM20、HSP60表達(dá)減少，但PINK1表達(dá)增高(P<0.05)，見圖6。

3 討論

本研究通過檢測(cè)分型鋸齒狀腺瘤組織和鋸齒狀腺癌組織中miR-181c的表達(dá)差異及其線粒體自噬的發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)miR-181c可能通過影響線粒體自噬的發(fā)生來調(diào)控鋸齒狀腺瘤癌變，對(duì)臨床上預(yù)防和治療鋸齒狀腺瘤癌變具有重要意義。

鋸齒狀腺瘤癌變途徑是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要途徑之一，近期研究表明，microRNA在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，如SCHMITZ等[11]檢測(cè)miR-21在鋸齒狀腺瘤和增生性息肉中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)可惡變的鋸齒狀腺瘤中miR-21的表達(dá)水平較無惡變風(fēng)險(xiǎn)的增生性息肉組織明顯升高；而AOKI等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-31在鋸齒狀腺癌中表達(dá)較正常結(jié)直腸組織明顯升高，提示其為鋸齒狀腺癌癌變的一個(gè)關(guān)鍵分子。由此可見，miRNA的表達(dá)差異在鋸齒狀腺瘤癌變途徑中可能發(fā)揮重要作用。但目前其具體機(jī)制尚不清楚。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，miR-181c可負(fù)調(diào)控色素C氧化酶亞單位MT-COX1，又可促進(jìn)MT-COX2的表達(dá)水平，破壞正常線粒體功能。線粒體是關(guān)乎細(xì)胞生命活動(dòng)極其重要的細(xì)胞器，其數(shù)量及質(zhì)量控制對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。而當(dāng)線粒體受損時(shí)，線粒體內(nèi)膜電位去極化，將PINK1激酶穩(wěn)定在線粒體內(nèi)膜上，進(jìn)而募集并激活Parkin(一種E3-泛素連接酶)依賴性的線粒體自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[8]。

本研究收集了經(jīng)病理證實(shí)的鋸齒狀腺癌20例為實(shí)驗(yàn)組，鋸齒狀腺瘤20例為對(duì)照組，應(yīng)用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)2組組織中miR-181c的表達(dá)變化情況，發(fā)現(xiàn)鋸齒狀腺癌組織中miR-181c表達(dá)較鋸齒狀腺瘤組織明顯減少，隨后在結(jié)直腸正常細(xì)胞FHC細(xì)胞及癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞中miR-181c表達(dá)較FHC細(xì)胞降低，與組織結(jié)果一致，提示miR-181c減少可能與鋸齒狀腺瘤癌變的發(fā)生相關(guān)。那么其是否是通過減少線粒體自噬的發(fā)生來促進(jìn)該癌變的發(fā)生？為此，本研究應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)了2組組織中TOM20、HSP60和PINK1蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在鋸齒狀腺癌組織內(nèi)TOM20及HSP60蛋白表達(dá)增加，而PINK1蛋白表達(dá)減少。TOM20及HSP60蛋白是線粒體剩余量的標(biāo)志，其表達(dá)升高提示線粒體自噬減少；PINK1蛋白是線粒體自噬相關(guān)蛋白，其表達(dá)降低提示線粒體自噬減少。同時(shí)在FHC細(xì)胞及Caco-2細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與組織實(shí)驗(yàn)一致，提示癌變的組織或細(xì)胞中線粒體自噬減少。應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)Caco-2細(xì)胞中miR-181c的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)線粒體自噬發(fā)生，提示miR-181c通過影響線粒體自噬發(fā)生而促進(jìn)癌變。

INDRIERI等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a/b表達(dá)下降可調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)，減少神經(jīng)元細(xì)胞死亡，可作為治療線粒體疾病相關(guān)神經(jīng)元病變的基因靶點(diǎn)。這與本研究結(jié)果相對(duì)應(yīng)，提示miR-181家族可調(diào)控線粒體自噬的發(fā)生而影響細(xì)胞凋亡。但本實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了miR-181c和線粒體自噬發(fā)生相關(guān)性的研究，未進(jìn)一步進(jìn)行因果關(guān)系分析及具體調(diào)控機(jī)制的探討，不能排除混雜因素的影響；隨后將進(jìn)一步通過細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-181c表達(dá)變化和線粒體自噬發(fā)生變化進(jìn)行因果關(guān)系研究，并尋找miR-181c調(diào)控線粒體自噬的具體分子機(jī)制。

綜上，miR-181c可能通過調(diào)控線粒體自噬發(fā)生參與鋸齒狀腺瘤癌變的過程，其有望成為結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)之一，具有重要的臨床意義。