周瀟妮，付振華，張琦玲，陳敏杰，蔡麗萍

(南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部2017級(jí)； b.研究生院醫(yī)學(xué)部2018級(jí)；c.瑪麗女王學(xué)院2019級(jí); d.第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，南昌 330006)

卵巢腫瘤具有多種復(fù)雜的組織學(xué)類型，其中上皮性來源的高級(jí)別漿液性卵巢癌(high-grade serous ovarian cancer,HGSOC)是原發(fā)性卵巢惡性腫瘤中最常見和最具代表性的組織學(xué)類型之一[1]。腹腔內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)移加上對(duì)化療藥物的耐藥是導(dǎo)致晚期HGSOC高病死率的主要原因。目前針對(duì)HGSOC的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案主要是進(jìn)行最大程度的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，同時(shí)聯(lián)合鉑類藥物的化療[2]。盡管此方案對(duì)初治患者有著較好的療效，但近75%的患者會(huì)在2年內(nèi)復(fù)發(fā)，且目前尚缺乏針對(duì)復(fù)發(fā)患者有效的藥物[3]。本研究基于GEO和TCGA兩大腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫，從拷貝數(shù)異常(copy number variations，CNVs)的角度出發(fā)，探討細(xì)胞周期相關(guān)基因在HGSOC發(fā)生及發(fā)展中的作用，從中尋找到相關(guān)靶點(diǎn)，為其靶向藥物的研發(fā)提供參考。

1 資料與方法

1.1 HGSOC患者CNVs基因的篩選

從TCGA數(shù)據(jù)庫(http://www.tcga.org/)中下載截至2019年6月5日的臨床HGSOC患者的CNVs基因，并以10%的突變頻率為截值獲取所需的CNVs基因。

1.2 HGSOC患者差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEG)的篩選

對(duì)美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)中的GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行全面搜索，以“ovarian cancer”和“ovarian carcinoma”作為搜索的關(guān)鍵詞，從該數(shù)據(jù)庫中直接下載HGSOC患者的DEG。之后設(shè)定P值10-9為截值，獲得所需要的HGSOC中DEG上調(diào)或下調(diào)的基因。

1.3 細(xì)胞周期相關(guān)通路和基因的篩選

以“cell cycle”“G0”“G1”“S”“G2”“M”等與細(xì)胞周期及其各個(gè)時(shí)期有關(guān)的關(guān)鍵詞作為篩選條件，分別從GSEA網(wǎng)站(https://www.gsea-msigdb.org/)的GO、KEGG、REACTOME、BIOCARTA數(shù)據(jù)庫中獲取與細(xì)胞周期相關(guān)的通路和基因。整合與HGSOC細(xì)胞周期相關(guān)、同時(shí)發(fā)生CNVs和差異表達(dá)的基因，獲取共突變基因。

1.4 共突變基因及表達(dá)蛋白的關(guān)聯(lián)性分析

將被篩選出的共突變基因輸入STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/)，獲取HGSOC患者基因表達(dá)蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

將被篩選出的共突變基因輸入cBioPortal網(wǎng)站(http://cbioportal.org/),獲取HGSOC患者基因關(guān)聯(lián)性分析圖和基因表達(dá)率圖譜。

1.5 共突變基因表達(dá)的生存預(yù)后分析

將被篩選出的共突變基因輸入KM-PLOT網(wǎng)站(https://kmplot.com/analysis/),得到對(duì)應(yīng)HGSOC患者特定基因表達(dá)時(shí)的無進(jìn)展生存率(PFS)和總體生存率(OS)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 HGSOC細(xì)胞周期相關(guān)基因的篩選

從GO、KEGG、REACTOME和BIOCARTA數(shù)據(jù)庫中確定178條與細(xì)胞周期相關(guān)的通路，同時(shí)建立包含3213個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)基因的集合(圖1)。從圖2可以發(fā)現(xiàn)，4個(gè)數(shù)據(jù)庫中各基因之間均存在交集。

2.2 HGSOC與細(xì)胞周期相關(guān)同時(shí)發(fā)生CNVs及差異表達(dá)基因的整合

從TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出拷貝數(shù)擴(kuò)增基因共1999個(gè);拷貝數(shù)缺失基因共47個(gè)。從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選出差異表達(dá)上調(diào)基因共827個(gè)；差異表達(dá)下調(diào)基因共950個(gè)。

將以上數(shù)據(jù)與之前篩選出的3213個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)的基因進(jìn)行整合，最終確定36個(gè)與HGSOC細(xì)胞周期相關(guān)、同時(shí)發(fā)生CNVs及差異表達(dá)的共突變基因。具體篩選步驟見圖3。

通過進(jìn)一步的整合分析可以發(fā)現(xiàn)，這36個(gè)共突變基因均來自拷貝數(shù)擴(kuò)增組，拷貝數(shù)缺失組為0個(gè)，見圖4。推測(cè)這些基因可能是通過拷貝數(shù)擴(kuò)增導(dǎo)致DEG上調(diào)，影響到細(xì)胞周期而發(fā)生HGSOC。

2.3 36個(gè)共突變基因表達(dá)蛋白的關(guān)聯(lián)性分析

將36個(gè)共突變基因利用STRING網(wǎng)站構(gòu)建成基因表達(dá)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖譜(圖5)，同時(shí)，結(jié)合從cBioPortal網(wǎng)站下載的基因關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)：MECOM、PRKCI的共表達(dá)概率約為32.5%，PRKCI、ECT2的共表達(dá)概率約為30.1%。提示在HGSOC患者中MECOM、PRKCI及ECT2出現(xiàn)共表達(dá)的概率較大，推測(cè)這3個(gè)基因之間可能共用同一條信號(hào)通路，在該信號(hào)通路的作用下促使HGSOC的發(fā)生發(fā)展，此推測(cè)待在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 36個(gè)共突變基因的關(guān)聯(lián)性分析

2.4 36個(gè)共突變基因在HGSOC患者中的表達(dá)及對(duì)生存率的影響

從cBioPortal網(wǎng)站下載的圖6A中可以發(fā)現(xiàn)，被篩選出的36個(gè)共突變基因在HGSOC患者中的擴(kuò)增表達(dá)量均較高，特別是MECOM、PRKCI、ECT2等在超過30%的HGSOC患者中存在高表達(dá)。另外，根據(jù)之前得到的DEG、CNVs數(shù)據(jù)分別制作出相對(duì)應(yīng)的圖形(圖6B—C)。通過KM-POLT網(wǎng)站下載的生存率曲線制作成生存預(yù)后分析圖(圖6D)。發(fā)現(xiàn)ECT2、RAD51AP1、YWHAZ、RAD21、SMC4、TFB2M等6個(gè)基因與HGSOC的不良生存預(yù)后顯著相關(guān)(HR>1，P<0.05)。若HGSOC患者中存在以上基因的高表達(dá)，則該患者的PFS與OS將大幅度下降(P<0.05)，見圖7。推測(cè)這6個(gè)基因很有可能作為HGSOC不良生存預(yù)后因子，在該疾病發(fā)生及發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要作用，可作為HGSOC藥物治療的潛在靶點(diǎn)。

3 討論

近年來，HGSOC患者基因的靶向治療具有較好的前景。其中，PARP抑制劑奧拉帕利目前已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)，推薦用于存在BRCA1、BRCA2基因突變的HGSOC患者的一線維持治療；同時(shí)還可用于鉑敏感復(fù)發(fā)的晚期HGSOC患者的二線維持治療[4]。然而針對(duì)部分?jǐn)y帶不同突變基因的HGSOC患者，PARP抑制劑的療效有所區(qū)別，這其中的機(jī)制尚未完全掌握。為此，尋找到更多HGSOC的治療靶點(diǎn)，為攜帶不同突變基因的HGSOC患者提供新的選擇，最終通過進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)“去化療”來改善晚期HGSOC患者化療耐藥的弊端是筆者研究的目的。

CNVs是指長度≥1 kb的DNA片段不同于參考基因組的情況，有10%～13%的DNA變化是由CNVs導(dǎo)致[5]。CNVs是人類遺傳變異的一個(gè)主要來源，它與基因的點(diǎn)突變一樣，會(huì)對(duì)個(gè)體差異造成影響。STRANGER等[6]發(fā)現(xiàn)，CNVs與人類基因組中17.7%的基因表達(dá)活性相關(guān)，并且拷貝數(shù)擴(kuò)增時(shí)可使其覆蓋區(qū)域或臨近區(qū)域的基因表達(dá)活性增強(qiáng)。同時(shí)，REID等[7]通過對(duì)全基因組的研究，證實(shí)了基因組區(qū)域中常見的CNVs事件，并且這些CNVs事件經(jīng)常在卵巢癌中發(fā)生，促進(jìn)了該疾病的發(fā)生及進(jìn)展。另外有研究表明1、2、3、4、5、6、9、11和12號(hào)染色體CNVs均與卵巢癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。因此，本研究從CNVs的角度出發(fā)，試圖挖掘出影響HGSOC發(fā)生及發(fā)展的靶點(diǎn)。

細(xì)胞周期是一個(gè)細(xì)胞復(fù)制其相關(guān)基因組，生長并分裂為2個(gè)子細(xì)胞的過程，它包含了生命最基本的特性之一。細(xì)胞周期調(diào)控涉及到很多基因和蛋白質(zhì)的參與，從而形成了一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，包括卵巢癌在內(nèi)的各種惡性腫瘤最主要的生物學(xué)特征是腫瘤細(xì)胞的失控性增殖，而細(xì)胞周期調(diào)控紊亂會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的失控性增殖。因此，研究細(xì)胞周期及其相關(guān)基因的表達(dá),有望找到腫瘤發(fā)生及發(fā)展的本質(zhì)。

本研究已挖掘出與細(xì)胞周期相關(guān),同時(shí)發(fā)生CNVs及差異表達(dá)的基因。最終發(fā)現(xiàn)有6個(gè)共突變基因與HGSOC的不良生存預(yù)后顯著相關(guān)，這6個(gè)基因分別為：ECT2、RAD51AP1、YWHAZ、RAD21、SMC4、TFB2M。其中ECT2、RAD51AP1、YWHAZ、RAD21已被證實(shí)與HGSOC之間的相關(guān)性。

1)ECT2主要定位于細(xì)胞核中,它在體外能夠激活RHOA、RAC1和CDC42,但在細(xì)胞中取決于具體環(huán)境的不同而具有更高的選擇性。從卵巢癌患者的腫瘤組織和已建立的細(xì)胞系中可以發(fā)現(xiàn)ECT2蛋白在大多數(shù)HGSOC患者中存在高表達(dá),提示ECT2蛋白與HGSOC的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[10]。2)RAD51AP1是一個(gè)在雙鏈DNA修復(fù)過程中起著重要作用的基因，它的表達(dá)與HGSOC之間表現(xiàn)出高度的同源性[11]。此外，HSAMir-140-3P是RAD51AP1的一個(gè)潛在調(diào)節(jié)因子，如果RAD51AP1是HGSOC的癌基因，那么靶向hsa-mir140-3p可能是一種靶向RAD51AP1的方法[12]。3)YWHAZ是14-3-3家族蛋白中的一員，影響著多種重要的細(xì)胞學(xué)過程。YWHAZ的過度表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，YWHAZ可能有助于早期癌癥的發(fā)展并促進(jìn)其向浸潤癌發(fā)生轉(zhuǎn)變[13]。原發(fā)性腫瘤中YWHAZ的高表達(dá)與腫瘤的早期復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[14]。SHI等[15]發(fā)現(xiàn)，YWHAZ的高表達(dá)與HGSOC的不良預(yù)后有關(guān)，它能夠促進(jìn)HGSOC細(xì)胞的增殖和遷移。4)RAD21是一種雙鏈斷裂修復(fù)蛋白，它是黏蛋白復(fù)合物的組成部分，在染色體分離和DNA修復(fù)中起著重要的作用。RAD21在未分化卵巢癌中已被證實(shí)存在過度表達(dá)[16]。AHN等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，RAD21與突變的P53相互作用可增加S1PR1的轉(zhuǎn)錄活性,從而增強(qiáng)HGSOC細(xì)胞的侵襲性。

總之，本研究篩選出的ECT2、RAD51AP1、YWHAZ、RAD21基因已被證實(shí)與HGSOC的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。另外，目前針對(duì)SMC4、TFB2M基因與HGSOC之間關(guān)聯(lián)性的研究較少，后續(xù)將進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以挖掘出HGSOC臨床治療的新靶點(diǎn)。