莫單丹 周小雷 唐炳蘭 周雅琴 孫國(guó)雄 谷筱玉*

1.廣西藥用植物園/廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023；2.廣西藥物不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，廣西 南寧 530023

番石榴葉為桃金娘科植物番石榴PsidiumguajavaLinn.的葉。中醫(yī)認(rèn)為具有收斂止瀉、消炎止血之功，用于久痢、泄瀉、創(chuàng)傷出血、皮膚濕疹、瘙癢、熱痱、牙痛。壯藥認(rèn)為具有調(diào)谷道、收斂止瀉、止血的功效，用于阿意咪(痢疾)、啊肉甜(糖尿病)、能唅能累(濕疹)、諾嚎噠(牙周炎)。炒番石榴葉收斂止瀉作用增強(qiáng)，用于單純性消化不良泄瀉,民間多用米炒番石榴葉治療腹瀉[1-4]。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載在《廣西壯族自治區(qū)壯藥藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(二卷)中，其炮制項(xiàng)下只記載炒番石榴葉為加大米適量共炒至米變黃色，未規(guī)范炮制輔料的量及炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本課題組前期對(duì)番石榴葉炮制品制備工藝進(jìn)行研究選出最佳炮制工藝，本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)番石榴葉炮制品進(jìn)行顯微特征、薄層色譜鑒別，并測(cè)定其水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的含量，采用HPLC對(duì)有效成分槲皮素[5-8]進(jìn)行含量測(cè)定，為番石榴葉炮制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋(邦西儀器科技(上海)有限公司，型號(hào)：HH-6)；電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：FA2004)；電子分析天平(CP2250D，Sartorius)；1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；超純水儀(美國(guó)Millipore Milli-Q Academic)；DZTW調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；炒藥機(jī)(山東青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司，型號(hào)：CY-50)；LEICA生物顯微(DM2000 LEICA/Germany)；硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司)。

1.2 試藥 番石榴葉采自廣西平樂(lè)、靖西、平南等地，經(jīng)廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙以民高級(jí)工程師、黃寶優(yōu)高級(jí)工程師和宋志軍副研究員鑒定為桃金娘科植物番石榴PsidiumguajavaLinn.的葉，共10批(見(jiàn)表1)。番石榴葉炮制品為將番石榴葉鮮品，除去雜質(zhì)，按番石榴：粳米為3∶1的比例粳米置炒藥機(jī)中共炒。在400 ℃條件下炒制20 min，粳米炒至焦黃色，取出，得番石榴葉炮制品飲片。實(shí)驗(yàn)中以番石榴葉(FSLY1)對(duì)應(yīng)的制品(Z1)為對(duì)照藥材。槲皮素對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：100081-201610，甲醇、磷酸、乙腈均為色譜純，乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇為分析純。

表1 番石榴葉樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微特征 本品粉末棕黃色。淀粉粒單粒多見(jiàn)，橢圓形，直徑4～8 μm，草酸鈣簇晶直徑35～40 μm，方晶、棕色塊多見(jiàn)，直徑8～20 μm。導(dǎo)管以螺紋導(dǎo)管為主，直徑30～70 μm，石細(xì)胞數(shù)量較少，棕黃色。非腺毛隨處可見(jiàn)，直徑10～20 μm，表皮細(xì)胞呈多邊形，氣孔為平軸式，木栓細(xì)胞棕黃色。如圖1所示。

1.淀粉粒 2.簇晶 3.方晶 4.氣孔 5.導(dǎo)管 6.棕色塊 7.木栓細(xì)胞 8.表皮細(xì)胞 9.纖維 10.非腺毛 11.石細(xì)胞圖1 番石榴葉炮制品粉末顯微特征圖

2.2 薄層鑒別 取本品粉末2 g(粉末過(guò)2號(hào)篩)，置具塞錐形瓶中，加入95%乙醇50 mL ，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，以石油醚萃取2次，每次10 mL，合并石油醚提取液，蒸干，殘?jiān)尤爰状? mL溶解作為供試品溶液。另取番石榴葉炮制品對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版通則0502)試驗(yàn)，吸取對(duì)照藥材、各批供試品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇 (20∶10∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃電熱板上加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，如圖2所示。

注：1～3：對(duì)照藥材(FSLY-Z1)4～12：樣品 (FSLY-Z2～FSLY-Z12)圖2 番石榴葉炮制品TLC

2.3 檢查 將上述10批番石榴葉炮制品根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》[9]方法進(jìn)行水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物的檢查。

2.3.1 水分 根據(jù)中國(guó)藥典2015 年版第四部通則0832水分測(cè)定法項(xiàng)下烘干法進(jìn)行測(cè)定。分別對(duì)上述10批藥材進(jìn)行水分測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，10批番石榴葉炮制品水分測(cè)定結(jié)果為4.16%～10.1%。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，考慮南方氣候較潮濕，結(jié)合儲(chǔ)藏過(guò)程中對(duì)水分控制的要求，暫定番石榴葉炮制品水分含量不得超過(guò)12%。

2.3.2 總灰分 根據(jù)中國(guó)藥典2015 年版第四部通則2302 灰分測(cè)定法項(xiàng)下總灰分測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。分別對(duì)上述批10制品進(jìn)行總灰分測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

結(jié)果顯示，10批番石榴葉炮制品總灰分測(cè)定結(jié)果為5.12%～6.40%。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，暫定番石榴葉炮制品總灰分含量不得超過(guò)7.0%。

2.3.3 酸不溶性灰分 根據(jù)中國(guó)藥典2015年版第四部通則2302灰分測(cè)定法項(xiàng)下酸不溶性灰分測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。分別對(duì)上述10批制品進(jìn)行酸不溶性灰分測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，10批番石榴葉酸不溶性灰分測(cè)定結(jié)果為 0.02%～0.20%。暫定番石榴葉炮制品酸不溶性灰分含量不得超過(guò)0.3%。

2.3.4 浸出物 以70%乙醇作溶劑，根據(jù)中國(guó)藥典2015年版第四部通則 2201醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下熱浸法進(jìn)行測(cè)定。分別對(duì)上述10批制品進(jìn)行浸出物含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明，10批番石榴葉炮制品浸出物含量測(cè)定結(jié)果為26.21%～32.56%。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，暫定番石榴葉炮制品藥材浸出物含量不得少于26.0%。

表2 番石榴葉炮制品水分、灰分、浸出物及槲皮素含量 (n=3，%)

2.4 含量測(cè)定[10-13]

2.4.1 色譜條件 色譜柱為迪馬C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.5磷酸的0.1三乙胺溶液(25∶75)；檢測(cè)波長(zhǎng)為372 nm ;流速為1.0 mL/ min;柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為12 μL。葛根素的理論塔板數(shù)不低于5000。如圖3所示。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 取槲皮素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制得每1 mL含槲皮素99 μg的溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取番石榴葉炮制品粉末(過(guò)4號(hào)篩)1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇溶液80 mL,加熱回流提取2 h，濾過(guò)，合并濾液，蒸干，殘?jiān)蒙V甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察 取4.2項(xiàng)制得的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件分別精密進(jìn)樣1、3、5、7、9、11 μL測(cè)定峰面積，以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸。得回歸方程為Y= 5799.3X+20.47,r=0.9999(n=6)。結(jié)果表明，槲皮素進(jìn)樣量在0.099～1.089 μg的范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

注：A.槲皮素對(duì)照品的HPLC圖； B.番石榴葉炮制品的HPLC圖圖3 番石榴葉炮制品的HPLC圖

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取取同一對(duì)照品溶液,按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。結(jié)果槲皮素峰面積的RSD為1.14%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于配制后 0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以槲皮素峰面積計(jì)算，結(jié)果的RSD為1.23%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品粉末，按供試品溶液制備方法平行制備6份，依法測(cè)定,記錄色譜圖。結(jié)果的RSD為1.99%(n=6),表明方法有良好的重現(xiàn)性。

2.4.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知槲皮素含量的番石榴葉炮制品(FSLY-Z5)粉末0.5 g，精密稱定，平行6份，分別精密加入與其含有等量的槲皮素對(duì)照品，按供試品制備方法制備供試液，按上述色譜條件測(cè)定槲皮素的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。計(jì)算槲皮素平均回收率為98.61%，RSD為1.56%。表明方法的回收率良好。

表3 番石榴葉炮制品中槲皮素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.4.9 樣品含量測(cè)定 按照上述供試品溶液制備方法和色譜條件，對(duì)上述10批番石榴葉炮制品中的槲皮素進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果含量在0.056%～0.130%之間，平均含量為0.0625%。該制品中槲皮素的含量限度建議以干燥炮制品計(jì)不得少于0.05%。

3 討論

實(shí)驗(yàn)分別取番石榴葉95%乙醇提取物、石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇等萃取物的溶液進(jìn)行點(diǎn)樣，以石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇不同比例為展開(kāi)劑進(jìn)行多次試驗(yàn)和篩選，發(fā)現(xiàn)取石油醚萃取物溶液點(diǎn)樣，以石油醚：三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇(20∶10∶1∶1)作為展開(kāi)劑，斑點(diǎn)比較清晰，分離度較好，可用于番石榴葉炮制品的薄層鑒別分析。

在色譜條件的摸索當(dāng)中，選擇了甲醇-0.5%磷酸溶液、甲醇-0.5%磷酸的0.1%三乙胺溶液、乙腈-0.5%磷酸的0.2%三乙胺；乙腈-0.5%磷酸的0.1%三乙胺溶液等不同濃度作為流動(dòng)相進(jìn)行多次試驗(yàn)和篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.5%磷酸的0.1%三乙胺溶液(25∶75)為流動(dòng)相，目標(biāo)峰明顯，對(duì)稱因子好。同時(shí)考察了220～500 nm范圍內(nèi)槲皮素的吸收光譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在372 nm處有強(qiáng)吸收峰，故選擇372 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

由于樣品的采收、加工和貯藏等因素，番石榴葉炮制品各樣品之間的水分、總灰分、浸出物和含量測(cè)定結(jié)果有一定的差異。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，考慮南方氣候較潮濕，結(jié)合儲(chǔ)藏過(guò)程中對(duì)水分控制的要求，建議番石榴葉炮制品藥材水分、總灰分及酸不溶性灰分分別不得過(guò)12%、7%、0.3%，醇溶性浸出物應(yīng)不少于26.0%，已有研究[5]表明番石榴葉苷類部位的止瀉作用與其槲皮素苷類含量呈相關(guān)性,其藥效受槲皮素苷類的含量變化影響,本研究選擇槲皮素含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)，番石榴葉炮制品中的槲皮素進(jìn)行含量測(cè)定結(jié)果在0.056%～0.130%之間，含量平均為0.0625%。根據(jù)樣品含量檢測(cè)結(jié)果，考慮炮制品原料藥產(chǎn)地、炮制加工等因素的影響，暫按含量平均值的80%擬定番石榴葉炮制品中槲皮素的含量應(yīng)不少于0.05%

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)描述了番石榴葉炮制品的顯微特征，并研究了其薄層鑒別方法，制定了番石榴葉炮制品水分、總灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物限度，建立了番石榴葉炮制品中槲皮素的含量測(cè)定方法并進(jìn)行驗(yàn)證，暫定番石榴葉炮制品藥材水分、總灰分及酸不溶性灰分分別不得過(guò)12%、7%、0.3%，醇溶性浸出物應(yīng)不少于26.0%；番石榴葉炮制品中槲皮素的含量應(yīng)不少于0.05%。本研究所建立的方法準(zhǔn)確可靠，為番石榴葉炮制品的質(zhì)量評(píng)估、監(jiān)管等提供科學(xué)依據(jù)。