晏相如 丁雨點 李順利 楊豆豆 何緒華 蔣文雯

貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025

近10年來，隨著現(xiàn)代基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等“組學(xué)”理論的發(fā)展，系統(tǒng)生物學(xué)視角的引入以及生物信息學(xué)的應(yīng)用,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué) (Network Pharmacology) 概念應(yīng)運而生[1-2], 它是在系統(tǒng)生物學(xué)與計算機技術(shù)高速發(fā)展的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的, 基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上, 通過網(wǎng)絡(luò)分析, 系統(tǒng)綜合地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響, 揭示多分子藥物協(xié)同作用于人體的奧秘[3]。這與中醫(yī)學(xué)從整體的角度去診治疾病的理論, 中藥及其復(fù)方的多成分、多途徑、多靶點協(xié)同作用的原理殊途同歸, 無疑為跨越中西醫(yī)間的鴻溝架起了橋梁, 為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化和國際化指明了方向。

川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，具有活血行氣，祛風(fēng)止痛的作用[4]。川芎主要含有揮發(fā)油、生物堿、有機酸等化學(xué)成分，有治療高血壓、抗血栓形成、抗氧化、神經(jīng)保護、抗腫瘤等藥理作用[5-7],其在臨床上可用于治療心血管疾病、眩暈癥、腎臟疾病等[8-9]。高血壓是危害人類健康的疾病之一，隨著社會的發(fā)展，無論是老人或是小孩都有患高血壓的幾率，且患病的人數(shù)在逐漸增加[10]。課題組推測活血化瘀中藥川芎或許能“擾動/抑制”高血壓相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)而對高血壓產(chǎn)生一定的治療效果，但其成分、靶點與作用機制等尚不明確。本研究依靠網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討川芎降血壓的作用靶點與可能的作用機制，為其抗高血壓的研究和臨床應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 川芎有效成分的篩選 川芎具有多成分、多靶點協(xié)同的作用，本研究采用TCMSP數(shù)據(jù)庫進行川芎有效成分篩選，該數(shù)據(jù)庫包括中國藥典注冊的499種中藥，含29 384種成分，3 311個靶標(biāo)和837個相關(guān)疾病，其特別的價值在于，它為每種化合物提供了藥物藥代動力學(xué)信息，如成藥相似性(DL)，口服生物利用度(OB)，血腦屏障(BBB)，腸上皮通透性(Caco-2)等參數(shù)。一般類藥性DL>0.18 、口服利用度OB>30%的分子具有較好的成藥可能，本研究根據(jù)中藥川芎的特性，設(shè)置DL>0.18, OB>30%，篩選其有效成分。

1.2 成分-靶點篩選 接下來通過已知的成分化合物，去尋找其可能作用的靶點。TCMSP數(shù)據(jù)庫采用的是 HIT數(shù)據(jù)庫預(yù)測算法SysDT 來獲得藥物靶點之間的關(guān)系。本研究首先利用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到預(yù)測的分子靶點，同時保存分子的mol2結(jié)構(gòu)文件；在Swiss-prot數(shù)據(jù)庫里輸入分子名得到預(yù)測的靶點，并保存分子3D結(jié)構(gòu)的sdf格式；pharmmapper數(shù)據(jù)庫應(yīng)用潛在作用靶點反向預(yù)測，進行藥效因匹配預(yù)測靶點并打分，Z’-score越大說明可能性越大，輸入分子3D結(jié)構(gòu)，提交并進行篩選得到分子的預(yù)測靶點。

1.3 疾病靶點收集 使用高血壓“hypertension”為關(guān)鍵詞在GeneCards(http://genecards.org)、CTD(http://ctdbase.org)、TTD(https://db.idblab.org/ttd)、OMIM(http://omim.org)數(shù)據(jù)庫力查找疾病靶點。

1.4 有效成分-疾病靶點 將上述所得成分的作用靶點與疾病靶點導(dǎo)入cytoscape進行merge分析，得成分-疾病交集靶點。Cytoscape 軟件源自美國系統(tǒng)生物學(xué)研究所，用于將生物分子交互網(wǎng)絡(luò)與高通量基因表達數(shù)據(jù)和其他的分子狀態(tài)信息整合在一起，其網(wǎng)絡(luò)圖包括節(jié)點(node)和邊(edge)，每個節(jié)點可以是基因、miNRA或蛋白質(zhì)等，節(jié)點與節(jié)點之間的連接 (edge) 代表著這些節(jié)點之間的相互作用。

1.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 研究蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于挖掘核心的調(diào)控基因。String是一個根據(jù)實驗數(shù)據(jù)、從PubMed摘要中文本挖掘的結(jié)果和綜合其他數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)等方法來研究蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫。將得到的交集基因輸入String中，以獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 基因通路構(gòu)建 將所得靶基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫，選擇P值小于0.05，進一步運用DAVID數(shù)據(jù)庫對網(wǎng)絡(luò)預(yù)測出的靶點所涉及的基因功能Gene-Ontology (GO) 進行注釋分析，并對相關(guān)通路(Pathway)進行KEGG 通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 主要成分信息 設(shè)置DL>0.18，篩選出川芎有效成分20個，再經(jīng)文獻查閱發(fā)現(xiàn)阿魏酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯是治療心血管疾病的有效成分，因此通過數(shù)據(jù)庫篩選和文獻查閱共得川芎有效成分23個。基本信息見表1。

表1 川芎有效成分

2.2 成分-靶點篩選與疾病基因收集 使用TCMSP、Swiss-prot、Pharmmapper三個數(shù)據(jù)庫對川芎有效成分潛在的作用靶點進行篩選收集，然后使用Uniprot數(shù)據(jù)庫將檢索到的所有靶點蛋白校正為其官方名稱(Officical Symbol)。共得到20個有效成分共167個作用靶點，其中3個成分沒有有效靶點。使用高血壓“hypertension”為關(guān)鍵詞在數(shù)據(jù)庫中查找，并將靶點名使用uniprot統(tǒng)一為基因名，共得到484個疾病靶點。

2.3 有效成分-疾病靶點 將以上所得成分的167個作用靶點與疾病484個靶點導(dǎo)入cytoscape進行merge分析，得到41個交集靶點，結(jié)果見圖1。

圖1 川芎治療高血壓的有效成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)分析 PPI網(wǎng)絡(luò)所得結(jié)果如圖2所示，將與高血壓有關(guān)的41個靶蛋白進行PPI互作分析，得到最主要的靶蛋白，其中degree=22的血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)；degree=20的轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)；degree=19的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、一氧化氮合酶(NOS3)、糖皮質(zhì)激素受體(NR3C1)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2);degree=18的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、表皮生長因子受體(EGFR)；degree=17的原癌基因c-Fos(FOS)；degree=15的低氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF1A)；degree=14的血紅素加氧酶1(HMOX1)、雄激素受體(AR)；degree=12的凝血酶原(F2)、細胞色素P4503A4(CYP3A4)等節(jié)點度值大，在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，提示川芎可通過調(diào)節(jié)以上生長因子、受體、酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、激活因子、轉(zhuǎn)錄因子、誘導(dǎo)因子類關(guān)鍵靶蛋白，發(fā)揮治療高血壓的作用。

2.5 基因通路結(jié)果 將所得41個靶基因?qū)隓avid數(shù)據(jù)庫，選擇P值小于0.05，基因通路構(gòu)建所得GO結(jié)果見表2、KEGG結(jié)果見表3。

表3 KEGG信號通路

2.6 GO生物過程分析 如表2所示，將川芎治療高血壓發(fā)揮作用的41個靶基因進行GO生物過程富集，選擇P<0.05的與高血壓有關(guān)的GO生物過程，主要為：MAPK活性的正調(diào)控、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、平滑肌細胞增殖的正調(diào)控、細胞對激素刺激的反應(yīng)、血管舒張的正調(diào)控、血壓的負調(diào)節(jié)、細胞增殖的負調(diào)控、鈣離子轉(zhuǎn)運的負調(diào)控、血管生成的正調(diào)控、血管收縮的正向調(diào)節(jié)等。提示川芎可能通過調(diào)控MAPK信號通路表達、阻斷血管收縮分子去氧腎上腺素等的生成、增加平滑肌細胞數(shù)量促進血管舒張、減少鈣離子進入細胞、促進血管生成和正向調(diào)節(jié)血管收縮等生物過程治療高血壓疾病。

2.7 KEGG信號通路分析 將川芎的41個靶點基因在David進行KEGG信號通路富集分析，根據(jù)P<0.05篩選得到影響心血管類疾病高血壓的相關(guān)信號通路15條，為了達到對基因進行注釋和分類的目的，將篩選得到的通路用Omicshare數(shù)據(jù)庫進行KEGG富集分析結(jié)果可視化，圖3所示。并將篩選所得通路與靶點用cytoscape作靶點-通路圖。分析篩選得到通路主要為：PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、鈣信號通路、雌激素信號通路、抗胰島素通路、VEGF信號通路、cGMP-PKG信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、多巴胺能神經(jīng)突觸、前列腺癌通路等。

圖3 川芎治療高血壓疾病的相關(guān)通路富集圖

3 討論

高血壓屬于心血管疾病的常見疾病之一，嚴重威脅著人類的健康，其發(fā)病機制較為復(fù)雜。川芎辛散溫通，功能活血祛瘀，作用廣泛，適用于各種瘀血阻滯之病癥。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對川芎治療高血壓的作用機制進行了預(yù)測，通過TCMSP、Swiss-prot、Pharmmapper、genecard、ctd等數(shù)據(jù)庫分別對成分靶點和疾病靶點進行篩選，并利用cytoscape軟件進行靶點與靶點相交繪制，發(fā)現(xiàn)川芎與VEGFA、HMOX1、PPARG、NOS3、FOS、PTGS2、JUN、HIF1A、STAT3、F2、CYP3A4、AR、EGFR、NR3C1等41個與高血壓相關(guān)的靶標(biāo)蛋白相互作用，隨后進行PPI互作分析得到節(jié)點度較高的核心靶點：血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、一氧化氮合酶(NOS3)、糖皮質(zhì)激素受體(NR3C1)、前列腺素G/H合成酶2、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)以及表皮生長因子受體(EGFR)和原癌基因c-Fos(FOS)。其中VEGFA在血管生成中起積極作用，誘導(dǎo)使血管通透性增加，VEGFA分泌水平升高會引起血管平滑肌(VSMCS)增殖水平的上升，參與高血壓誘導(dǎo)的血管重建。高血壓患者的微循環(huán)至大血管均有不同程度的血管內(nèi)皮受損發(fā)生， VEGFA具有促進血管內(nèi)皮增生、新生血管生成以及增加血管通透性的功能，血管內(nèi)皮能夠接受血液中的激素水平、壓力水平、炎癥介質(zhì)等相關(guān)信號，這些信號的接受會使得血管內(nèi)皮細胞分泌不同的生物活性物質(zhì)用以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞功能，參與血管的收縮與舒張，進而調(diào)節(jié)局部血管功能的完整性[11]，從而控制血壓。HMOX1在生理條件下活性最高的是脾臟，趙寧等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)HMOX1基因的rs59607267位點與原發(fā)性高血壓及血壓水平相關(guān)。NOS3通過cGMP介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與血管平滑肌舒張，產(chǎn)生的NO介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)冠狀動脈血管生成，并通過激活血小板識別因子促進凝血，高鵬等[13]的研究發(fā)現(xiàn)NOS3基因14號內(nèi)含子rs3918181多態(tài)性與高血壓的發(fā)生相關(guān)，進一步證實了該基因與高血壓發(fā)生的相關(guān)性。

通過KEGG通路分析，研究發(fā)現(xiàn)川芎主要通過HIF-1信號通路、鈣信號通路、VEGF信號通路、PI3K-Akt信號通路、cGMP-PKG信號通路、TNF信號通路、雌激素、胰島素抵抗以及前列腺癌等通路的調(diào)控以治療高血壓疾病。

血管損傷是一個慢性、低度炎癥反應(yīng)的過程，它是高血壓、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的始動環(huán)節(jié)及共同的病理學(xué)基礎(chǔ)[14]。有研究表明TNF-α即腫瘤壞死因子-α在原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制中起重要作用，TNF-α不但參與機體的免疫防御功能，而且還是重要的炎癥促進因子，可通過多種途徑促進平滑肌細胞增殖，使平滑肌細胞內(nèi)鈣快速升高，引起血管收縮，進而導(dǎo)致血壓升高[15]。

HIF-1是由HIF-1α和HIF-2β兩個亞基構(gòu)成，HIF-1α 作為缺氧條件下的重要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)血管的生成及細胞的凋亡和自噬，并參與調(diào)節(jié)多條信號通路。其中VEGF是受HIF-1直接調(diào)控的細胞生長因子，可通過與其特異性受體VEGFR結(jié)合激活酪氨酸蛋白激酶活性，促進新生血管的形成,提高血管通透性[16-17]。

PI3K/ Akt和其它一些下游通路可在壓力負荷誘導(dǎo)高血壓癥中被激活[18]，PI3K/ Akt信號通路在調(diào)控細胞凋亡增殖的信號通路中發(fā)揮重要作用，通過激活A(yù)kt及其下游靶點p53等，促進細胞周期進展、增殖、生存和抗凋亡，從而影響血管內(nèi)皮的細胞凋亡,此外雌激素涉及到P13K-Akt通路生成血管舒張因子NO、影響MAPK通路進而調(diào)節(jié)血壓。

VEGF信號通路中VEGF因子是促血管新生作用最強的細胞因子, 不僅可以促進內(nèi)皮細胞的增殖以及血管結(jié)構(gòu)的形成，還能促進血流和血管通透性的改變。高血壓導(dǎo)致心肌肥大，是心臟自身針對血流動力學(xué)因素改變，通過自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)而發(fā)生的一種適應(yīng)性改變，有研究發(fā)現(xiàn)肥大的心肌細胞VEGF表達增強[19]。

鈣信號通路通過調(diào)節(jié)Ca2+通道，穩(wěn)定血壓，鈣可以使外周血管阻力增加，從而導(dǎo)致血壓升高，也有研究認為鈣可以增加血管平滑肌細胞膜的穩(wěn)定性，緩解精神緊張性血壓升高，降低血管內(nèi)源性加壓素的反應(yīng)，促進尿鈉排泄，減少血容量，解除Na-K-ATP酶的活性抑制，增強鈉和鉀的主動轉(zhuǎn)運，舒張血管平滑肌，降低血壓[20]。

川芎除主要作用于上述通路以外，雌激素可降低血管通透性和血清膽固醇，松弛素作為胰島素超家族的多肽激素之一，具有血管生成和舒張血管的作用，催產(chǎn)素能減少人體內(nèi)腎上腺酮等壓力激素的水平，以降低血壓。

隨著科學(xué)研究的不斷深入，新的藥物靶點以及降壓藥不斷出現(xiàn)，使得高血壓疾病的治療得到更多的改善。此次研究結(jié)果初步闡釋了川芎治療高血壓的作用機制，為開展探索川芎治療高血壓疾病相關(guān)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及藥理作用機制研究奠定了良好的基礎(chǔ)。