王 東

（重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶 404155）

獼猴桃含有多種有機物以及鈣、鉀、硒、鋅、鍺等微量元素和人體所需的17種氨基酸，還含有豐富的維生素C、葡萄酸、果糖、檸檬酸、蘋果酸、脂肪。由于其富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，深受人們的喜愛。但是在獼猴桃的生長過程中，往往會受到各種病害的影響，不利于獼猴桃的正常生長發(fā)育。為了盡可能降低病害對獼猴桃生長的影響，就要不斷提高獼猴桃自身的抗病害能力，這就需要對其進行抗性鑒定，優(yōu)選高質(zhì)量的品種。

不同品種的獼猴桃對于病害的抵抗能力不盡相同，為了能夠優(yōu)選其中抗病能力高的品種，需要對實生苗進行系統(tǒng)全面的抗性鑒定，并選擇與之相適應(yīng)的砧木。當(dāng)前，國內(nèi)外在獼猴桃抗病機理方面的相關(guān)研究較少，并且其所選擇的抗性評價機制也存在一定的差別，這就導(dǎo)致獼猴桃的抗性鑒定指標(biāo)并不完善。為了對獼猴桃生理指標(biāo)與抗性之間的關(guān)系進行更進一步的分析研究，并優(yōu)選與之相適應(yīng)的抗病性砧木，通過對獼猴桃的實生苗擴繁后代進行病菌侵染、抗病性分級以及篩選抗性砧木，對侵染前后獼猴桃的生理參數(shù)進行對比分析，進而優(yōu)選抗病能力強的獼猴桃品種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所選用的獼猴桃品種為“徐香”和“布魯諾”兩種，其中，2個品種的獼猴桃實生苗均有13個株系，苗齡均為2個月。所選用的抗性鑒定病原菌為青枯假單孢桿菌，主要是通過LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，整個培養(yǎng)過程均正常。

1.2 病菌的侵染

為了降低實驗過程中其他因素的影響，要盡可能確保獼猴桃實生苗的整體情況相似，在“徐香”和“布魯諾”兩個品種中篩選長勢情況相近的獼猴桃實生苗植株各3株，并采用109cfu/ml的病菌菌液分別對其葉片進行直接的活體接種，確保植株能夠順利地感染上病菌。為了確保接種質(zhì)量，選用的接種方法為針刺法，具體操作為：在每株獼猴桃實生苗中篩選5片面積較大的葉片，分別在其上用針頭扎4次，針扎的位置要盡可能遍布整個葉片，避免針扎位置過于集中，影響后續(xù)的感染對比分析。完成所有植株的接種后，將組培苗移至組培室進行下一步的培養(yǎng)感染，同時，還要注重為獼猴桃實生苗提供適宜的生長環(huán)境，將溫度控制在（25±2）℃，光周期為16 h/8 h（光/暗），濕度需要結(jié)合植株的生長情況進行有針對性的調(diào)節(jié)控制。連續(xù)培養(yǎng)14 d，在整個培養(yǎng)過程中要連續(xù)觀察獼猴桃實生苗植株的染病情況，最后統(tǒng)計相應(yīng)的病情指數(shù)，其具體的計算公式為：

1.3 抗性生理參數(shù)的測定

2個品種的獼猴桃實生苗各13個株系并且每個株系的3株獼猴桃葉片接種病原菌之后的5d，分別選取具有一定代表性的若干葉片，摘取對其中的CAT和POT酶活性進行測定。同時，為了更好地進行對比分析，從未感染病菌的其余株系中選取3株長勢與實驗組相近的獼猴桃植株，對其中的酶活性進行測定。

1.3.1 酶液的提取

分別稱取健康和染病獼猴桃葉片鮮樣0.5g，放在預(yù)先冷卻好的研缽中進行充分的研磨處理。研磨前需要加入2 mL提取液（pH為7.8的磷酸緩沖液）和0.01 g的PVPP，在冰浴的作用下將葉片研磨成均勻的漿液，以其中不含葉片小塊為宜，再將研磨好的漿液移至離心管中，同時采用清水對研缽進行清洗，一同倒入離心管中，確保最后離心管中的液體為10 mL，在6 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，完成后取上清液備用。

1.3.2 CAT酶活性測定

向試管中加入2 mL濃度為50 mmol/L的PBS（pH控制在 7.0），再加入 5 μL的濃度為 30%的 H2O2和50 μL的酶液，最后再加入1 mL濃度為50 mmol/L的PBS進行充分地混合。同時，取3 mL濃度為50 mmol/L的PBS作為空白組用于調(diào)零處理。為了盡可能減少誤差，需要對其中的OD240進行快速檢測，每間隔60 s進行一次讀數(shù)，連續(xù)測量4 min。CAT酶活性的計算公式如下所示：

式中：V——酶液總體積，mL；a——測定的酶液體積，mL；w——樣品鮮質(zhì)量，g。

1.3.3 POD酶活性測定

先在試管中加入2 mL的POD反應(yīng)液，再加入30 μl的酶液，最后加入1 mL的POD反應(yīng)液進行充分混合。同時，取3 mL的POD作為空白組用于調(diào)零處理。為了盡可能減少誤差，需要對其中的OD470進行快速的檢測，每間隔60 s進行一次讀數(shù)，連續(xù)測量4 min。其中，POD反應(yīng)液是由0.125 mL愈創(chuàng)木酚+0.255 mL濃度30%的H2O2，用濃度為50 mmol/L的PBS定容至250 mL。POD酶活性的計算公式如下所示：

式中：V——酶液總體積，mL；a——測定的酶液體積，mL；w——樣品鮮質(zhì)量，g。

1.4 感病程度分級標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)獼猴桃植株葉片感染程度的不同，將感病程度依次分為0～7級，其中，0級為沒有出現(xiàn)任何感病癥狀；1級為葉片的接種處和其周圍的一定范圍內(nèi)出現(xiàn)了白化病斑；3級為植株葉片呈現(xiàn)嚴(yán)重的黃化病癥，并且伴隨出現(xiàn)較多的褐化病斑；5級為植株整體葉片已經(jīng)出現(xiàn)較大面積的焦枯，而且少量莖部已經(jīng)開始逐漸腐爛；7級為葉片大部分脫落，莖部腐爛嚴(yán)重，甚至植株開始呈現(xiàn)死亡的癥狀。

獼猴桃植株的抗性等級按照以下標(biāo)準(zhǔn)進行評定：

病情指數(shù)＜5的植株為高抗品種（HR）；5≤病情指數(shù)＜15的植株為抗病品種（R）；15≤病情指數(shù)＜35的植株為耐病品種（T）；35≤病情指數(shù)＜55的植株為感病品種（S）；55≤病情指數(shù)為高感品種（HS）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同株系的病情指數(shù)和抗性評價

對所有參與實驗的徐香和布魯諾獼猴桃植株按照病情指數(shù)對植株的抗性進行評價，結(jié)果如表1所示。

表1 不同株系獼猴桃的病情指數(shù)及抗性評價表Tab.1Diseaseindexandresistanceevaluationofdifferentkiwifruitstrains

根據(jù)上表能夠看出，徐香品種的實生苗整體抗性要優(yōu)于布魯諾品種，而同一品種不同株系內(nèi)的抗病性之間也存在一定的差別。徐香品種內(nèi)主要為高抗、抗病以及耐病等3種耐病等級，不存在感病和高感類型，并且這3種耐病等級分布較為均勻，總體來說，徐香品種的獼猴桃實生苗具有較強的抗性。布魯諾品種的抗病性主要分布為：抗病、耐病以及感病3種類型，不存在高抗品種，而高感品種也僅有1株，總體來說，布魯諾品種的獼猴桃實生苗抗病性較弱。根據(jù)抗病等級，優(yōu)選徐香2號和布魯諾3號實生苗作為抗性砧木進行嫁接，進而確保嫁接苗具有良好的抗病能力。

2.2 CAT、POD酶活性與獼猴桃抗性的關(guān)系

通過對徐香和布魯諾參與實驗所有植株的CAT和POD酶活性進行系統(tǒng)全面的檢測，結(jié)果如表2所示。由表2能夠看出，相較于健康植株，這兩個品種的獼猴桃實生苗感病之后，其葉片內(nèi)酶活性呈現(xiàn)快速升高的趨勢，并且所呈現(xiàn)的變化趨勢相似。同時，還能看出徐香品種正常植株葉片內(nèi)CAT和POD酶的活性普遍低于布魯諾品種，而徐香品種感病植株葉片內(nèi)CAT和POD酶的活性出現(xiàn)大幅提高，并且普遍高于感病后的布魯諾品種，這就表明CAT和POD酶的活性與獼猴桃的抗性之間存在一定的因果關(guān)系，即感病后酶的活性越高，植株的抗病能力也就越強。

表2 不同獼猴桃品種感染病菌前后CAT和POD活性的變化表Tab.2 Changes of cat and POD activities of different kiwifruit varieties before and after infection with pathogen

3 結(jié)語

總而言之，通過上述的實驗分析，徐香2號和布魯諾3號實生苗的抗病性較強，可以將兩者作為抗性砧木，通過嫁接提高獼猴桃植株的抗病能力。同時，CAT和POD酶的活性能夠用于不同品種砧木的抗性鑒定指標(biāo)，通過優(yōu)選酶活性高的砧木就能獲得抗病能力高的砧木品種，進而促進獼猴桃抗病能力的不斷提高。