周忠福 趙文霞 林若竹 淮穩(wěn)霞 姚艷霞

(國家林業(yè)與草原局森林保護(hù)學(xué)重點實驗室 中國林業(yè)科學(xué)院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 北京 100091)

新疆野生蘋果(Malussieversii)(薔薇科)屬第三紀(jì)孑遺植物，是現(xiàn)代栽培蘋果品種的祖先，是我國乃至世界十分珍貴的自然種質(zhì)資源，在野生種質(zhì)資源利用和生物多樣性保護(hù)方面具有非常重要的價值(林培鈞等， 2000)。新疆野生蘋果僅分布于中亞地區(qū)，是我國新疆西天山野果林最主要的建群種，占野果林總面積的90%。然而，近年來，新疆野生蘋果林出現(xiàn)大面積死亡現(xiàn)象，使這種珍稀種質(zhì)資源面臨著嚴(yán)重的威脅，其中，以蘋小吉丁(Agrilusmali)(鞘翅目Coleoptera: 吉丁甲科Buprestidae)為主的病蟲害是一項非常重要的影響因子(崔志軍， 2018； Bozorovetal.， 2019)。

蘋小吉丁在國外分布于俄羅斯、蒙古和朝鮮半島，在我國分布于黑龍江、遼寧、山東、河北、陜西、四川、甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙古、河南等十多個省(自治區(qū))(王智勇， 2013； EPPO， 2018)，以幼蟲蛀食寄主樹木枝干而造成危害，枝條被害處表皮呈黑褐或深褐色，稍下凹，受害枝條常常干枯，主要危害蘋果屬(Malus)和李屬(Prunus)植物(Bozorovetal.， 2019； EPPO， 2018)。由于蘋小吉丁在新疆西天山野果林內(nèi)暴發(fā)，已有超過80%的野生蘋果樹受到蘋小吉丁的危害(崔志軍， 2018)。根據(jù)伊犁地區(qū)林業(yè)部門的統(tǒng)計，截至2015年，受害嚴(yán)重的新源縣野生蘋果枯死率高達(dá)80%，局部地區(qū)100%，蘋小吉丁為害被認(rèn)為是引起新疆野生蘋果死亡的重要生物因子(Bozorovetal.， 2019;季英等， 2004； 王智勇， 2013)。

事實上，昆蟲伴生的真菌類群常常加速了害蟲對寄主植物的危害。伴生菌是由昆蟲攜帶、傳播到寄主植物上，并對寄主植物產(chǎn)生不利影響的病原真菌(葉輝，1997)，也稱為蟲道真菌(楊群芳等， 2008)。迄今為止，昆蟲伴生真菌研究最廣泛的是涉及小蠹科(Scolytidae)昆蟲的種類，其與小蠹科伴生關(guān)系最密切，研究最深入的真菌當(dāng)屬長喙殼類(呂全， 2007； Kostovciketal.， 2015； Luetal.， 2010; 2011； 2016)。其次，象甲科(Curculionidae)昆蟲的伴生真菌也有研究報道，相比小蠹與真菌的緊密伴生關(guān)系，除了極少數(shù)能與真菌形成互惠的共生關(guān)系外, 象甲和真菌之間的伴生關(guān)系主要是松散的、隨機的(Drenkhanetal.， 2017； Viiri， 2004; Robertetal.， 2013a； 2013b)。此外，極少數(shù)天牛種類如斷眼天牛(Tetropium)據(jù)記載也與真菌伴生，主要是長喙殼類真菌(Wingfieldetal.， 1987； Johnyetal.， 2012)。吉丁甲科的昆蟲種類鮮有伴生真菌的報道，截至目前，僅發(fā)現(xiàn)Agrilusgraminis是一些黃萎病真菌(Verticillium)的活性載體(Rizieroetal.， 2016)。

調(diào)查、分析昆蟲伴生真菌多樣性，了解其群落結(jié)構(gòu)有助于探討害蟲、伴生真菌與寄主植物三者的相互關(guān)系。本研究運用真菌學(xué)和群落生態(tài)學(xué)方法，對蘋小吉丁伴生真菌類群及其多樣性進(jìn)行調(diào)查研究，旨在了解和探明蘋小吉丁優(yōu)勢伴生菌群類群，為探討蘋小吉丁及其伴生真菌與新疆野生蘋果之間的相互作用和危害過程中是否存在伴生真菌協(xié)同發(fā)生作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

新疆野生蘋果在我國境內(nèi)主要分布在天山西部伊犁河谷地區(qū)海拔 1 200 ～1 600 m 的陰坡、半陰坡和河谷地帶，該地區(qū)屬北溫帶大陸性半干旱氣候區(qū)，氣候溫和，年平均氣溫10.4 ℃，年積溫為2 700～3 500 ℃，全年日照時數(shù)2 532～2 722 h，年降水量315.6～798.3 mm，年均無霜期156天。新疆野生蘋果伴生有野生櫻桃李(Prunuscerasifera)、野杏(Armeniacavulgarisvar.ansu)、準(zhǔn)噶爾山楂(Crataegussongarica)、天山樺(Betulatianschanica)等樹種，林下伴生有灌木新疆忍冬(Loniceratianschanica)、黑果小檗(Berberisatrocarpa)、 腺齒薔薇(Rosaalbertii)和覆盆子(Rubusidaeus) 等，草本植物有鴨茅(Dactylisglomerata)、新疆黨參(Codonopsisclematidea)、苦苣菜(Sonchusoleraceus)、野芝麻(Lamiumbarbatum)、早熟禾(Poaspp.)、羊茅(Festucaovina)、麻葉蕁麻(Urticacannabina)和大麻(Cannabissativa)等(李利平等， 2011； 馬闖等， 2018； 張高， 2013)。

1.2 樣地設(shè)置

新疆野生蘋果在伊犁河谷地區(qū)呈散生或團狀分布，伊犁哈薩克自治州的新源縣、鞏留縣、霍城縣、伊寧縣均有分布，其中新源縣和鞏留縣野生蘋果分布最多且受蘋小吉丁危害最重。故本研究選取目前蘋小吉丁危害最嚴(yán)重的庫爾德寧鎮(zhèn)阿勒馬賽(43.23°N，82.85°E)、闊克塔力村(43.25°N, 82.82°E)和七十二團八連(43.24°N, 82.77°E)為采樣地，每個樣地大小為100 m×100 m。

1.3 取樣方法

1.3.1 幼蟲、蛹及坑道取樣方法 在蘋小吉丁幼蟲出蟄危害季節(jié)(5—9月)，每5～7天在樣地內(nèi)隨機選取50個帶蟲枝條(長50 cm，基徑3～6 cm)，帶回實驗室剝?nèi)∮紫x、蛹及坑道。由于幼蟲和蛹所處環(huán)境大致相同，故把二者合并在一起分析。

1.3.2 成蟲取樣方法 在成蟲羽化高峰期使用捕蟲網(wǎng)捕捉成蟲，隨后將每頭成蟲單獨放入1.5 mL無菌離心管中待用。

1.4 真菌分離與培養(yǎng)

1.4.1 蟲體棲息真菌分離 從受害枝條剝?nèi)』铙w幼蟲和蛹立即置于麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基(麥芽浸粉20 g、瓊脂20 g，去離子水1 000 mL)中，用無菌鑷子使其在培養(yǎng)基上滾動2圈后取出蟲體，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約1周后，適時挑取不同形態(tài)特征的菌落，轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)和菌種保藏。

將活體成蟲切成5 mm × 5 mm的小塊，用 1.5%次氯酸鈉處理1 min、無菌水漂洗3次，并置于MEA培養(yǎng)基中，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約1周后，適時挑取不同形態(tài)特征的菌落，轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)和菌種保藏。

1.4.2 坑道棲息真菌分離 小心切下幼蟲取食部位的新鮮韌皮或蛹室木質(zhì)部組織，將其剪成小塊，立即接種到培養(yǎng)基上，并于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)組織材料周圍生出菌絲時，挑取形態(tài)不同的菌落，轉(zhuǎn)入 PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)和菌種保藏。

1.5 菌株 DNA 提取以及目標(biāo)基因片段的 PCR 擴增及測序

純化菌株在MEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后，刮取約1 g菌絲，根據(jù)CTAB 法提取純化菌株的DNA，PCR擴增采用ITS1和 ITS4通用引物。擴增產(chǎn)物由上海美吉生物公司測序，序列經(jīng)BioEdit等軟件進(jìn)行拼接處理，在NCBI基因庫進(jìn)行同源性比對分析，確定分類地位。

1.6 數(shù)據(jù)分析

相對多度(Pi)=某一伴生菌的分離株數(shù)/總伴生真菌的分離株數(shù)×100%。如果某一真菌類群在群體中的度Pi>1/S，則該類群為優(yōu)勢菌群，反之，則該類群為次要類群，S為群體中類群總數(shù)(Camargo，1992)。

選用Jaccard 指數(shù)和Bray-Curtis指數(shù)分析不同分離材料之間伴生真菌物種組成的差異性，具體計算過程通過R語言 vegan軟件包中的vegdist函數(shù)完成。

另外，選取Shannon-Wiener指數(shù)Pielou均勻度和Margalef 豐富度指數(shù)來分析物種多樣性。Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)具體計算過程通過R語言 vegan軟件包中的diversity函數(shù)完成，Margalef 豐富度指數(shù)用Excel計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋小吉丁伴生真菌種類及其數(shù)量

共分離得到菌株703株，隸屬真菌57屬(表1)，其中：鏈格孢屬(Alternaria)獲得214株，鐮刀菌屬(Fusarium)97株，殼囊孢屬(Cytospora)55株，小穴殼屬(Dothiorella)49株，其余各屬菌株數(shù)量在40株以下。

表1 蘋小吉丁伴生真菌區(qū)系組成及數(shù)量①Tab.1 The genera composition and the relative abundance of associated fungi with A. mali

在這些真菌類群中，處于優(yōu)勢地位(相對多度Pi>1/S=1/57)的有10屬(圖1)，所包含菌株數(shù)量占總菌株數(shù)量的78.13%。其中：鏈格孢屬相對多度最大，其次是鐮刀菌。其余8個優(yōu)勢屬相對多度在2%～8%范圍內(nèi)，從大到小依次為殼囊孢屬、小穴殼菌屬、芽枝霉屬(Cladosporium)、莖點霉屬(Phoma)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、亞隔孢殼屬(Didymella)、煙管菌屬(Bjerkandera)，短梗霉屬(Aureobasidium)最小，僅為1.85%。

圖2 不同分離材料伴生真菌的相對多度Fig.2 Relative abundance of the associated fungi from the different isolation materials

圖1 蘋小吉丁伴生真菌優(yōu)勢屬的相對多度Fig.1 Relative abundance of dominant genera of associated fungi with A. mali

2.2 不同分離材料伴生真菌類群的分布

不同分離每個伴生真菌類群的相對多度如圖2所示。從同一分離材料的所有伴生類群分布看，幼蟲+蛹體表共分離得到菌株151株，隸屬于34屬，鏈格孢屬、芽枝霉屬、殼囊孢屬、亞隔孢殼屬、小穴殼菌屬、鐮刀菌屬、裂褶菌屬和栓菌屬為優(yōu)勢屬，小穴殼菌屬相對多度最高，為13.91%，其次是鏈格孢屬(13.21%)，再為鐮刀菌屬(11.92%)； 成蟲共分離到菌株328株，隸屬37屬，其中鏈格孢屬、芽枝霉屬、鐮刀菌屬、莖點霉屬為優(yōu)勢屬，鏈格孢屬相對多度最高，為50.30%，鐮刀菌屬次之(15.85%)，芽枝霉屬(8.23%)在鐮刀菌之后； 坑道共得菌株224株，隸屬40屬，其中鏈格孢、煙管菌屬、殼囊孢屬、亞隔孢殼屬、小穴殼菌屬、鐮刀菌屬、莖點霉屬和栓菌屬為優(yōu)勢屬，殼囊孢屬相對多度最高，為16.96%，然后是鏈格孢(12.95%)和鐮刀菌屬(12.05%)。由此可見，鏈格孢和鐮刀菌屬在幼蟲+蛹、成蟲和坑道中均大量存在，特別是鏈格孢在成蟲中的相對多度表現(xiàn)的非常突出，高達(dá)50.30%。

此外，從真菌類群來看，3種分離材料均具有各自的伴生真菌類群，如細(xì)球腔菌屬(Leptosphaeria)、殼滿孢屬(Plenodomus)、臥蠟孔菌屬(Ceriporia)等6屬僅存在于幼蟲+蛹的伴生真菌類群中，黏束孢屬(Graphium)、異擔(dān)子菌屬(Heterobasidion)、炭團菌屬(Hypoxylon)等10屬僅存在于成蟲中，隱球殼屬(Cryptosphaeria)、青霉菌屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)等6屬僅存在于坑道中。

2.3 不同分離部位伴生真菌組成的差異性

蘋小吉丁各分離部位除具各自特異性伴生真菌外，還擁有共同伴生真菌類群，如圖3所示。在獲得的57屬伴生真菌中，幼蟲+蛹與坑道共有的伴生真菌為27屬(45.76%)，成蟲與坑道共有的伴生真菌為26屬(45.61%)，幼蟲+蛹和成蟲共有的伴生真菌為20屬(35.10%)，而為上述3種分離部位所共有的伴生真菌達(dá)19屬(33.33%)。

另外，Jaccard指數(shù)和Bray-Curtis指數(shù)反映出的結(jié)果是不一致的(表2)，其中：幼蟲+蛹與成蟲的Jaccard相異性指數(shù)和Bray-Curtis相異性指數(shù)較大，而幼蟲+蛹與坑道的相異性指數(shù)均較小。對于Bray-Curtis相異性指數(shù)，幼蟲+蛹與成蟲、成蟲與坑道較為接近，都在0.6～0.7之間，但相比幼蟲+蛹與坑道(0.333)差異較大；對于Jaccard指數(shù)，幼蟲+蛹與坑道、成蟲與坑道較為接近(0.4～0.5)，但相比幼蟲+蛹與成蟲(0.608)差異較大。綜合分析2種相異性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，幼蟲+蛹和成蟲之間相異性較大，如果只考慮物種的有無，成蟲和坑道的相異性較小(0.490)，而如果不僅考慮物種的有無，而且還考慮不同物種的相對豐度時，成蟲和坑道之間的相異性較大(0.609)。

圖3 不同分離材料真菌類群組成的數(shù)量關(guān)系Fig.3 Venn diagram of the fungi groups for different isolation materials

表2 不同分離材料之間伴生真菌類群相似性比較Tab.2 Paired comparison of β dissimilarity indices for different isolation materials

2.4 不同分離部位伴生真菌多樣性分析

由坑道分離的伴生真菌Shannon-Wiener多樣性指數(shù)最高，幼蟲+蛹體表略低于坑道，成蟲最低，并與前二者相差較大(圖4)。幼蟲+蛹體表伴生真菌類群數(shù)量不如成蟲多，但Shannon-Wiener指數(shù)卻大于后者，說明前者類群中個體分配上的均勻性(Evenness)較好(圖4)。從Pielou 均勻度指數(shù)看，幼蟲+蛹最高，坑道次之，成蟲則明顯低于前二者，說明幼蟲+蛹伴生真菌屬與屬之間個體數(shù)量差別不大，而成蟲伴生真菌屬與屬之間個體數(shù)量差別較大。而從Margalef豐富度指數(shù)來看，三者中坑道最高，成蟲最低。成蟲3種指數(shù)均為最低，說明成蟲攜帶真菌種類以少量真菌類群為主。

圖4 不同分離材料之間伴生真菌的多樣性比較Fig.4 Comparison of the diversity of the associated fungi from different isolation materials

3 討論

本文首次系統(tǒng)性研究了蘋小吉丁伴生真菌類群及其多樣性，從蘋小吉丁幼蟲、蛹、成蟲和坑道中共分離鑒定了57屬真菌類群，隸屬于6綱18目。上述57屬中處于優(yōu)勢地位的有10屬，其中鏈格孢屬的數(shù)量最多。盡管不同分離材料伴生真菌分布不同，然而從處于優(yōu)勢地位的真菌類群及其相對多度來看，鏈格孢屬在幼蟲+蛹、成蟲和坑道中均大量存在，特別在成蟲中相對多度表現(xiàn)非常突出，高達(dá)50.30%，可能是因為鏈格孢屬的分生孢子容易釋放，并且通過氣流傳播，在空氣中廣泛存在，蘋小吉丁成蟲喜歡在天氣晴朗、溫度稍高的時候繞樹冠飛行，這為其接觸并攜帶鏈格孢提供了便利條件。鏈格孢主要引起寄主植物葉斑和葉枯病，也可引起果腐病，如蘋果果腐和蘋果果斑(王婧等， 2017； George， 2009)。由于許多鏈格孢屬真菌是腐生真菌，僅在死亡或者正在腐爛的植物組織上生長，因而在一些衰老的葉片、花瓣和成熟的果實上最常見(George， 2009)，但從蘋小吉丁患病幼蟲蟲體上也分離到鏈格孢[細(xì)鏈格孢(Alternariatenuis)](孔婷婷等， 2017)，因此，蘋小吉丁和鏈格孢是否復(fù)合危害野果樹尚待進(jìn)一步研究。

鐮刀菌是本研究獲得的另外一個優(yōu)勢真菌類群，在3種分離材料中均處于優(yōu)勢地位。在小蠹蟲伴生菌研究中，鐮刀菌與小圓胸小蠹(Euwallaceaefornicatus)形成蟲菌共生體方胸小蠹-鐮孢菌共生體(Euwallacea-Fusarium)(Freemanetal., 2013; O’Donnelletal.， 2016; Kassonetal.， 2013)，造成寄主機械損傷、枝干枯死和木材腐爛(Walgama, 2012)。這些危害狀在受蘋小吉丁危害的樹體上均有表現(xiàn)，并且在害后發(fā)生褐變的野生蘋果心材部分也發(fā)現(xiàn)了多種鐮刀菌(Chengetal.， 2019)，由此推測蘋小吉丁與鐮刀菌在引起野生蘋果枝枯的過程中均產(chǎn)生了影響。

此外，能引起多種植物潰瘍病的重要真菌類群小穴殼菌屬和殼囊孢屬(張星耀等，1999； 王秀娟等， 2019； 王斌等， 2018)在蘋小吉丁幼蟲+蛹和坑道中大量存在，前者在幼蟲+蛹中表現(xiàn)突出，相對多度最高(13.91%)，后者在坑道中相對多度高達(dá)16.96%，因此，不能排除這些真菌類群對野果林產(chǎn)生的危害。與此同時，本研究從蘋小吉丁成蟲中分離到黏束孢屬(Graphium)真菌，該屬許多種類與小蠹蟲形成伴生關(guān)系(Jacobsetal.， 2003; Yamaokaetal.， 2009); 但蘋小吉丁成蟲與小蠹蟲生活習(xí)性完全不同，前者不進(jìn)入寄主植物內(nèi)部生活，僅在補充營養(yǎng)時取食寄主，因此，蘋小吉丁成蟲與該真菌的相互關(guān)系還有待進(jìn)一步探討。

從不同分離部位的伴生真菌數(shù)量來看，蘋小吉丁危害的坑道中真菌類群最多，這可能與真菌本身對環(huán)境的要求有關(guān)，受到創(chuàng)傷的植物組織給真菌的侵入提供了有利條件(葉建仁等， 2011)； 幼蟲+蛹真菌類群最少可能是因為健康的蟲體只允許那些對其有利的真菌類群存在。從Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分析的結(jié)果來看，由坑道分離的伴生真菌Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)最高，與坑道真菌類群最多相一致，但是幼蟲+蛹體表伴生真菌Shannon-Wiener指數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成蟲，前者伴生真菌種類數(shù)量不如后者多，但該指數(shù)卻大于后者，說明前者伴生真菌種類中個體分配上的均勻性好于后者，也就是說幼蟲+蛹體表伴生真菌屬與屬之間個體數(shù)量差別不大，而成蟲伴生真菌屬與屬之間個體數(shù)量差別較大，Pielou 均勻質(zhì)指數(shù)的分析結(jié)果證實了這一點，同時Margalef 豐富度指數(shù)分析結(jié)果也與上述結(jié)果相一致，三者中坑道最高，成蟲最低。由于上述多樣性指數(shù)與地理位置、環(huán)境條件及樹木微環(huán)境息息相關(guān)(王立祥等， 2017)，成蟲3種多樣性指數(shù)均最低，而幼蟲+蛹和坑道3種指數(shù)相對差異較小，因此推測可能是幼蟲+蛹與坑道微環(huán)境相似而與成蟲環(huán)境條件相差較大導(dǎo)致。此外，成蟲3種指數(shù)均為最低，也說明成蟲攜帶真菌種類以少量真菌類群為主，且主要攜帶真菌種類所占比例在伴生真菌類群中較大。

與此同時，蘋小吉丁上述3種分離材料除擁有共同伴生真菌類群外，各自存在某些特異性較強的真菌種類。幼蟲+蛹和成蟲均與坑道存在共有伴生真菌，說明伴生真菌與坑道環(huán)境關(guān)系密切(Adamsetal.， 2007)。另外，盡管成蟲和幼蟲相異性較大(Jaccard=0.608，Bray-Curtis=0.683)，但二者共有伴生真菌類群也達(dá)20屬，表明雖然幼蟲+蛹和成蟲所生活環(huán)境差別較大，但一些真菌類群和蘋小吉丁關(guān)系十分密切，可能依靠蘋小吉丁傳播擴散。

4 結(jié)論

蘋小吉丁伴生真菌種類較多，且不同分離材料的真菌類群種類和數(shù)量存在差異。在這些真菌類群當(dāng)中，鏈格孢和鐮刀菌是蘋小吉丁整個生活史發(fā)育過程中的主要伴生真菌類群，而鐮刀菌的種類常常引起植物枝枯和褐腐，同時，引起植物潰瘍病的重要真菌類群——小穴殼菌屬和殼囊孢屬在幼蟲+蛹和坑道中大量存在，可能存在某些與蘋小吉丁關(guān)系十分密切的伴生真菌類群，說明對野果林造成危害的不僅僅是蘋小吉丁，真菌對野果林的衰退也可能產(chǎn)生了較大的影響。因此,對退化野果林生態(tài)保育與健康調(diào)控要從多個方面考慮，把真菌所致病害和蟲害綜合治理相互結(jié)合起來。