孫偉博 宮新棟 周 燕 李紅巖

(南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院 南京 210037)

楊樹(Populus)是世界上中緯度平原地區(qū)主要的人工種植速生樹種之一，也是我國重要的經(jīng)濟(jì)林木，具有生長快、產(chǎn)量高、成林早、易加工等眾多優(yōu)勢，是人工速生豐產(chǎn)林的主要樹種(趙桂華， 2011)。楊樹作為木本植物與草本植物相比較，生長周期長，并且屬于光合效率較低的C3植物，其光能利用率低(Yuanetal.， 2017)，與理想的光能利用率差距較大，因此，提高光合作用的效率對于木本植物尤其是楊樹等速生樹種的生長具有促進(jìn)作用。在自然界中，玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)等作物屬于C4植物，具有較高的光合效率，能夠有效濃縮CO2，這些植物的CO2補(bǔ)償點(diǎn)低、光合補(bǔ)償點(diǎn)高，使得它們在適宜環(huán)境中和逆境條件下均能有更高的光合效率。因此，將C4植物光合作用的關(guān)鍵基因引入C3植物進(jìn)行表達(dá)，是解決相關(guān)問題的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域(Ishimaruetal.， 1998； Huoetal.， 2017； Sivarametal.， 2018)。

對C4植物光合能力具有重要作用的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenol pyruvate carboxylase，PEPC)，其酶活性強(qiáng)，是1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活性的60倍，對CO2親和力大(Singhetal.， 2012)； 另外一個(gè)關(guān)鍵的限速酶即磷酸丙酮酸二激酶(phosphopyruvate dikinase，PPDK)，該酶主要分布于葉肉細(xì)胞的葉綠體中，催化CO2最初受體PEP的再生(Wangetal.， 2012)。二者是C4植物具有高效光合作用的關(guān)鍵。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、小麥(Triticumaestivum)等C3植物中也成功獲得了轉(zhuǎn)C4型PEPC基因的植株，并相應(yīng)提高了其光合效率(Lebouteilleretal.， 2007； Chenetal.， 2004)； 將玉米PPDK基因轉(zhuǎn)化到水稻(Oryzasativa)中，葉片總N含量明顯升高(嚴(yán)建民等， 2003)； 使用共轉(zhuǎn)法獲得的轉(zhuǎn)PEPC和PPDK基因水稻株系，其孕穗期葉綠素?zé)晒鈪?shù)及相關(guān)生理生化指標(biāo)等均有顯著提高(崔紅云等， 2012)。本研究選取C4植物玉米中的PEPC和PPDK基因，并通過基因工程手段將這2種基因轉(zhuǎn)化南林895楊(P.deltoides×P.euramericana‘Nanlin 895’)，獲得穩(wěn)定高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，并對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測、生理生化檢測以及相關(guān)功能分析，為培育楊樹高光效新品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取玉米植株(B73品系)的葉片用于基因克隆，南林895楊植株作為轉(zhuǎn)化的目的材料并進(jìn)行分子及生理檢測。

1.2 玉米PEPC及PPDK基因信息挖掘及分析

選擇ZeamaysEnsembl-18和ZeamaysPH207 V1.1數(shù)據(jù)庫(https:∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)進(jìn)行PEPC和PPDK基因的相關(guān)信息挖掘，分別以phosphoenolpyruvate carboxylase和pyruvate phosphate dikinase為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，對搜索結(jié)果依據(jù)功能注釋、保守功能域結(jié)構(gòu)及家族標(biāo)簽進(jìn)行篩選。

1.3 玉米PEPC和PPDK表達(dá)分析

利用real-time qPCR技術(shù)對PEPC和PPDK基因在玉米中時(shí)空表達(dá)差異進(jìn)行分析。PEPC基因real-time qPCR引物為： 正向： 5′-TCACACATGCT GATCCTGGC-3′，反向： 5′-GTCAGGACGAGGTCAAC AGT-3′；PPDK基因real-time qPCR引物為： 正向： 5′-GCTCAAAATGCACCAGGGAC-3′，反向： 5′-TTGT TGCCCTCGCTCTTGCC-3′。

1.4 目的基因的克隆及載體構(gòu)建

使用多糖多酚RNA提取試劑盒(北京天根生化)進(jìn)行RNA提取； cDNA的合成使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)； 目的基因克隆及擴(kuò)增所使用菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)Trans1-T1菌株(Transgen)和大腸桿菌TOP10菌株(北京天根生化)； 擴(kuò)增所使用載體為pTOPO-T(Transgen)。根據(jù)目的基因保守區(qū)設(shè)計(jì)3′及5′端引物(PEPC引物序列： 正向： 5′-CCTCTCGCTCCGTCC-3′，反向： 5′-CCATAGATAT GATCCCCTACAGA-3′；PPDK引物序列： 正向： 5′-ATGGCGGCATCGGTTTCC-3′，反向： 5′-CAAGCACC TGAGCTGCAG-3′)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收目的片段，經(jīng)擎科公司測序正確后，利用Gateway系統(tǒng)將目的基因分別構(gòu)建到植物表達(dá)載體pGWB406中(圖1)，目的基因通過重組反應(yīng)連接到attR1和attR2之間，啟動子為花椰菜花葉病毒35S啟動子。

圖1 pGWB406載體圖譜Fig.1 Vector map of pGWB406P35S： 花椰菜花葉病毒35S啟動子； attR1和attR2： 重組反應(yīng)識別位點(diǎn)； CmR： 氯霉素抗性基因； ccdB： Gateway載體自殺序列； ori： 復(fù)制起始位點(diǎn)； aadA(SpcR)： 壯觀霉素抗性基因； PNOS： 胭脂堿合酶NOS啟動子； NPTII： 卡那霉素抗性基因； TNOS： 胭脂堿合酶NOS終止子； LB： T-DNA左邊界； RB： T-DNA右邊界。P35S: CaMV 35S promoter; attR1 and attR2: Recognition sites of recombination reaction; CmR: Chloramphenicol resistant gene; ccdB: Suicide sequence at Gateway vector; ori: Origin of repulication; aadA(SpcR): Spectinomycin resistant gene; PNOS: Nopaline synthase NOS promoter; NPTII: Kanamycin resistant gene; TNOS: Nopaline synthase NOS terminator; LB: T-DNA left border; RB: T-DNA right border.

1.5 楊樹遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測

將含有目的基因的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium)EHA105，采用南林895楊葉盤進(jìn)行侵染，預(yù)培養(yǎng)1天，侵染菌液OD值為0.8。侵染結(jié)束用無菌濾紙吸干多余菌液，將葉盤置于分化培養(yǎng)基(MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ TDZ 0.002 mg·L-1+ 蔗糖 30 g·L-1+ 瓊脂 6.5 g·L-1+ 頭孢霉素 100 mg·L-1)，暗培養(yǎng)3天，將葉盤置于分化篩選培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基 + 卡那霉素25 mg·L-1+ 特美汀 100 mg·L-1)，長芽后轉(zhuǎn)入芽生長篩選培養(yǎng)基(MS + 6-BA 0.2 mg·L-1+ TDZ 0.001 mg·L-1+ 蔗糖 25 g·L-1+ 瓊脂 6.5 g·L-1+ 卡那霉素20 g·L-1+ 頭孢霉素 100 mg·L-1+ 特美汀 100 mg·L-1)，最后轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(1/2 MS + 蔗糖 20 g·L-1+ 瓊脂 6.5 g·L-1+ 卡那霉素 10 mg·L-1+ 頭孢霉素 100 mg·L-1+ 特美汀 100 mg·L-1)，于溫室培養(yǎng)，每隔20天更換培養(yǎng)基至獲得完整抗性植株。

篩選抗性植株，進(jìn)行PCR檢測，PEPC基因的引物為PEPC35S-F: 5′-GCAAGACCCTTCCTCTATAT-3′，PEPC-C-R: 5′-CTTAAGAGCAGTGTCAACCC-3′，檢測片段長度851 bp；PPDK基因的引物為PPDK35S-F: 5′-GCAAGACCCTTCCTCTATAT-3′，PPDK-C-R: 5′-GTAGACCTCCTTGTACTGAC-3′，檢測片段長度為832 bp。

1.6 轉(zhuǎn)基因楊樹植株的表達(dá)分析

選用actin為內(nèi)參基因，分別以組培瓶中生長3個(gè)月的組培苗和移栽溫室中2個(gè)月約60 cm高的盆栽苗為試驗(yàn)材料，對PEPC和PPDK基因在南林895楊中表達(dá)量進(jìn)行分析，具體試驗(yàn)參照1.3 所述方法。蛋白表達(dá)分析選取組培瓶中生長3個(gè)月的南林895楊轉(zhuǎn)基因植株和對照組植株的葉片，分別提取總蛋白并利用Bradford方法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度對待檢測蛋白樣品進(jìn)行定量，通過SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳，檢測分析轉(zhuǎn)基因植株與對照組蛋白表達(dá)差異。

1.7 轉(zhuǎn)基因楊樹光合作用相關(guān)參數(shù)及葉綠素指標(biāo)測定

使用GFS-3000便攜式光合儀測定已在溫室中生長2個(gè)月的南林895楊盆栽苗的光合參數(shù)，選擇6、7月份晴朗無云的天氣條件下7:00—19:00之間的整點(diǎn)時(shí)刻進(jìn)行測定。測定植株選擇相同時(shí)間移栽、長勢相同且健壯的幼苗，每個(gè)株系取5株，測定從植株頂端數(shù)第3—5片長勢相同的葉片，每個(gè)植株測定3片，每個(gè)處理重復(fù)3次。測定數(shù)據(jù)包括光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)及對CO2響應(yīng)、對光照響應(yīng)及光合效率(LUE)等。光合效率的計(jì)算： 凈光合速率與光合有效輻射的比值。

CO2響應(yīng)的測定條件： 光合有效輻射1 200 μmol·m-2s-1，葉室溫度30 ℃，相對濕度60%； 相關(guān)參數(shù)通過回歸分析獲得。CO2濃度在0～1 000 μmol·mol-1范圍內(nèi)，每隔100 μmol·mol-1，設(shè)定若干梯度，測定對應(yīng)的光合速率值。

光響應(yīng)的測定條件： 葉室CO2濃度350 μmol·mol-1，葉室溫度30 ℃，相對濕度60%； 相關(guān)參數(shù)通過回歸分析獲得。光合有效輻射在0～1 400 μmol·m-2s-1范圍內(nèi)，每隔100 μmol·m-2s-1，設(shè)定若干梯度，測定對應(yīng)的光合速率值。

1.8 轉(zhuǎn)基因楊樹生長指標(biāo)測定

對南林895楊轉(zhuǎn)基因株系和對照組的生長狀況進(jìn)行測定記錄，在轉(zhuǎn)入花盆中生長60天后對株高、地徑進(jìn)行測量記錄，分別選取不同植株相同位置的葉片進(jìn)行面積和質(zhì)量測定，每個(gè)植株選取生長狀態(tài)一致的8片葉片。生長量測定，每個(gè)株系選定3個(gè)樣本，40天后從花盆中取出清洗干凈，75 ℃干燥至恒重后進(jìn)行測量。

1.9 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 16.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差計(jì)算及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米PEPC及PPDK基因序列

利用生物信息學(xué)工具對玉米PEPC和PPDK基因編碼蛋白進(jìn)行分析和預(yù)測，蛋白理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位如表1所示，PEPC蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，PPDK蛋白定位于葉綠體中，與其家族蛋白亞細(xì)胞定位一致，2個(gè)蛋白與各自家族蛋白成員相同均不含有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，并各自具有本家族蛋白保守的結(jié)構(gòu)基序和活性位點(diǎn)。PEPC基因編碼蛋白序列中，具有形成與PEPC蛋白家族功能密切相關(guān)的典型裂縫結(jié)構(gòu)的4個(gè)保守基序(FHK-x-W，SWYKWP，TAHPT-x-R，M-x-GYSDS-x-K-x-G，其中x為非保守位點(diǎn))，并具有保守的活性催化位點(diǎn)K和H；PPDK基因編碼蛋白序列中，具有與PPDK蛋白家族催化作用密切相關(guān)的3個(gè)保守基序(K-x-P-x-DL-x-N-x-YK，G-x-NDL-x-Q-x-R，G-G-x-H-x-R)及保守的活性催化位點(diǎn)K和H。通過對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行的生理生化、結(jié)構(gòu)域基序、信號肽、功能位點(diǎn)等相關(guān)分析和預(yù)測，表明玉米PEPC和PPDK基因編碼蛋白均具有其相關(guān)家族高度保守的功能域，2個(gè)基因均為光合作用關(guān)鍵酶的編碼基因。

表1 PEPC和PPDK蛋白理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位Tab.1 Physicochemical properties and subcellular localization of PEPC and PPDK proteins

2.2 玉米PEPC和PPDK基因的表達(dá)模式

對PEPC和PPDK基因在玉米中的表達(dá)進(jìn)行分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因在植株發(fā)育的不同階段及不同組織中表達(dá)量均存在差異。在拔節(jié)期、穗期和花粒期3個(gè)發(fā)育階段，PEPC和PPDK2個(gè)基因在葉片中表達(dá)量明顯高于莖中表達(dá)量。隨著發(fā)育生長，2個(gè)基因在葉片中表達(dá)量呈上升趨勢，即花粒期>穗期>拔節(jié)期。在莖中這種趨勢并不明顯，PEPC基因花粒期在莖中的表達(dá)量低于穗期，PPDK基因在花粒期和穗期的表達(dá)量無明顯差異。在不同生長階段中，PEPC基因的表達(dá)量均高于PPDK基因。PEPC和PPDK基因在葉片中表達(dá)占優(yōu)勢，與其參與光合作用的生理過程相一致。

2.3 轉(zhuǎn)基因楊樹分子檢測及基因表達(dá)

2.3.1 楊樹遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測 侵染的葉盤在共培養(yǎng)3天后轉(zhuǎn)移到分化篩選培養(yǎng)基，待抗性芽生長健壯后轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基，最后將幼苗置于生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)獲得完整的轉(zhuǎn)化植株。幼苗培養(yǎng)3個(gè)月后可轉(zhuǎn)移到土壤中生長。具體過程如圖3a-f所示。

圖3 轉(zhuǎn)基因南林895楊的獲得及分子檢測Fig.3 Obtainment and molecular detection of transgenic ‘Nanlin 895’ poplarsa-f: 轉(zhuǎn)基因植株獲得； g: PCR檢測； h, i: 葉片內(nèi)蛋白含量分析。CK: 對照組； M: Marker； PEPC1-5： 轉(zhuǎn)PEPC基因5個(gè)株系； PPDK1-3： 轉(zhuǎn)PPDK基因3個(gè)株系。a-f: Process of transformation; g: PCR detection; h, i: Analysis of protein content of leaves. CK: Control lines; M: Marker; PEPC1-5: 5 PEPC transgenic lines; PPDK1-3: 3 PPDK transgenic lines.

圖2 PEPC和PPDK基因在不同發(fā)育階段玉米莖、葉中的表達(dá)量Fig.2 Relative expression of PEPC and PPDK gene in stems and leaves of Zea mays at different developmental stages

對篩選獲得的陽性植株進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明PEPC獲得5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，PPDK獲得3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(圖3g)。對轉(zhuǎn)基因植株蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)PEPC基因植株和PPDK基因植株中，均有目的蛋白條帶(PEPC基因編碼蛋白約110 kDa，PPDK基因編碼蛋白約103 kDa)存在，對照組中沒有表達(dá)(圖3h、i)，表明基因已轉(zhuǎn)化到南林895楊中并正常表達(dá)。同時(shí)，電泳結(jié)果表明各轉(zhuǎn)基因株系間葉片中蛋白含量無顯著差異。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因楊樹的基因表達(dá) 對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行real-time qPCR檢測，比較轉(zhuǎn)基因株系間的基因表達(dá)水平，對基因表達(dá)組織特異性進(jìn)行分析，并對不同時(shí)期轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行比對。

在轉(zhuǎn)基因植株組培苗中，PEPC和PPDK基因在葉片中表達(dá)量顯著高于莖中。PEPC在不同株系間表達(dá)量差異明顯，PEPC-3株系表達(dá)量最低，PEPC-5株系表達(dá)量最高，是PEPC-3株系表達(dá)量的1.79倍；PPDK基因在3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量無顯著差異(圖4a)。未轉(zhuǎn)基因南林895楊中無目的基因，故沒有其表達(dá)量分析結(jié)果。

對轉(zhuǎn)基因植株盆栽苗表達(dá)分析結(jié)果表明，PEPC基因表達(dá)量比PPDK基因表達(dá)量高，同時(shí)葉片中的基因表達(dá)量高于莖中(圖4b)，這與組培苗時(shí)期(圖4a)相同，但差距更為明顯。以組培苗葉片基因表達(dá)量最低值(即PPDK-2)作為基數(shù)，分別計(jì)算組培苗和盆栽苗植株葉片中基因表達(dá)量的平均值與此基數(shù)的比值(圖4c)，比對結(jié)果表明，盆栽苗葉片中2個(gè)基因的表達(dá)量顯著高于組培苗時(shí)期，與生長時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系，這可能與植物葉片生長、光合作用提高有直接關(guān)系。

另一方面，對轉(zhuǎn)基因的盆栽苗進(jìn)行了不同光照處理(圖5)，結(jié)果表明2個(gè)基因表達(dá)量均在高光照條件下升高，高光照下基因表達(dá)量是低光照條件下的2～3倍，基因表達(dá)受光照條件調(diào)控作用明顯。

圖4 PEPC和PPDK基因在轉(zhuǎn)基因南林895楊莖葉中的表達(dá)Fig.4 Relative expression of PEPC, PPDK genes in stem and leaf of transgenic ‘Nanlin895’ poplarsa： 組培苗； b： 盆栽苗； c： 組培苗與盆栽苗葉片中表達(dá)量比對，以組培苗葉片基因表達(dá)量最低值(即PPDK-2)作為基數(shù)。a: Tissue culture plantlets; b: Potted young plants; c: Comparison of expression in leaves between tissue culture plantlets and potted young plants, taking the lowest gene expression value(PPDK-2) in leaves of tissue culture plantlets as the base value.

圖5 轉(zhuǎn)基因南林895楊在不同光照條件下PEPC和PPDK基因的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of PEPC and PPDK gene in transgenic ‘Nanlin895’ poplars under different light conditions

2.4 轉(zhuǎn)基因楊樹的光合作用水平

2.4.1 光合速率日變化 南林895楊轉(zhuǎn)基因株系及對照植株的凈光合速率(圖6)在一天當(dāng)中均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。PEPC-1、PEPC-2株系呈現(xiàn)單峰狀態(tài)，對照組和PEPC-3、PEPC-4和PEPC-5株系均呈現(xiàn)雙峰變化趨勢，其中PEPC-5株系雙峰狀態(tài)最為明顯且最大值高于對照組16.2%。轉(zhuǎn)PPDK基因株系均未出現(xiàn)雙峰狀態(tài)，且凈光合速率的最大值低于轉(zhuǎn)PEPC基因植株。與對照組相比，轉(zhuǎn)基因株系在早晨及傍晚低光照條件下凈光合速率出現(xiàn)低于對照組的情況。

圖6 南林895楊轉(zhuǎn)基因株系和對照組的凈光合速率(Pn)日變化Fig.6 Diurnal change of net photosynthetic rate(Pn) in transgenic ‘Nanlin895’ poplars and control不同小寫字母表示不同株系間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，下同。Different lowercase letters represent significant difference among lines(P<0.05), the same below.

2.4.2 氣孔導(dǎo)度日變化 所有植株的氣孔導(dǎo)度在一天當(dāng)中的變化趨勢相同，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。轉(zhuǎn)PEPC基因植株在中午高光照條件下，氣孔導(dǎo)度均顯著高于對照組(P<0.05)； 在早晨和傍晚，大部分轉(zhuǎn)基因株系的氣孔導(dǎo)度低于對照組(圖7)。5個(gè)PEPC株系的氣孔導(dǎo)度日變化也存在差異性：PEPC-1和PEPC-2株系的氣孔導(dǎo)度在10:00后一直呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，在15:00出現(xiàn)大幅下降(PEPC-1下降27.6%，PEPC-2下降31.3%)；PEPC-3和PEPC-4株系及對照組植株的氣孔導(dǎo)度在10:00—14:00之間出現(xiàn)波動趨勢，具有雙峰值，其中對照組植株的谷值出現(xiàn)在13:00而轉(zhuǎn)基因株系PEPC-3和PEPC-4的谷值出現(xiàn)在12:00且均高于對照組谷值；PEPC-5株系的氣孔導(dǎo)度在13:00之前一直維持較低水平，在14:00出現(xiàn)峰值后一直到16:00均維持較高水平。轉(zhuǎn)PPDK基因植株的氣孔導(dǎo)度在10:00之前與對照組無顯著差異(P<0.05)，在13:00—16:00之間高于對照組，各株系間差異不顯著。另一方面，與氣孔導(dǎo)度相關(guān)的蒸騰速率的測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株與對照組之間無顯著差異。

圖7 轉(zhuǎn)基因南林895楊和對照組的氣孔導(dǎo)度(Gs)日變化Fig.7 Diurnal change of stomatal conductance(Gs) in transgenic ‘Nanlin895’ poplars and control

2.4.3 胞間CO2濃度日變化及光合速率對CO2濃度的響應(yīng) 南林895楊轉(zhuǎn)基因株系與對照組的胞間CO2濃度均在7:00出現(xiàn)峰值，在中午時(shí)間段出現(xiàn)下降趨勢。除PPDK-2株系外，轉(zhuǎn)基因株系都檢測到比對照組更高的胞間CO2濃度，表明轉(zhuǎn)基因株系比對照組有強(qiáng)的CO2固定能力。在CO2濃度為0～700 μmol·mol-1的區(qū)間中，轉(zhuǎn)基因株系及對照組的光合響應(yīng)強(qiáng)度均呈線性增長，之后隨CO2濃度的升高，逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)(圖8)。除PEPC-4株系外，轉(zhuǎn)PEPC和轉(zhuǎn)PPDK基因株系的光合響應(yīng)在任何CO2濃度下均高于對照組，表明轉(zhuǎn)基因植株光合能力較對照組增強(qiáng)。

圖8 轉(zhuǎn)基因南林895楊和對照組對CO2濃度的光合響應(yīng)變化Fig.8 Changes of photosynthetic response to CO2 concentration of transgenic ‘Nanlin895’ poplars and control

2.5 轉(zhuǎn)基因楊樹的生長性狀及生物量

盡管光合作用參數(shù)表明轉(zhuǎn)PEPC和PPDK基因的南林895楊植株具有更高效的光合作用，但是植物生長并不是單一的生理過程。因此，評價(jià)轉(zhuǎn)基因株系的優(yōu)劣需要進(jìn)行生物學(xué)性狀的比較。對同一批次的轉(zhuǎn)基因植株及對照組植株進(jìn)行株高、地徑、葉片質(zhì)量及葉片面積的測量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株在多個(gè)指標(biāo)上優(yōu)于對照組(圖9)，但是具有顯著差異的僅有PEPC-3和PEPC-4株系，這2個(gè)株系在株高與葉片質(zhì)量指標(biāo)上顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)。其中，PEPC-3和PEPC-4株系平均株高分別高于對照組5.6%和2.9%，葉片面積分別高于對照組13.8% 和8.9%，葉片質(zhì)量分別高于對照組23.6%和19.8%，地徑分別高于對照組13.5% 和5.4%，證明在PEPC-3和PEPC-4株系中，PEPC基因的表達(dá)對植株的生長性狀產(chǎn)生了顯著影響。

圖9 轉(zhuǎn)基因南林895楊和對照組的生長性狀Fig.9 The growth of transgenic ‘Nanlin895’ poplars and control*表示轉(zhuǎn)基因植株與對照組數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，下同。* represents significant difference between transgenic poplars and control(P<0.05), the same below.

進(jìn)一步對轉(zhuǎn)基因植株和對照組植株的生物量進(jìn)行測定比較，結(jié)果如圖10所示。所有植株的根生物量沒有明顯差異； 轉(zhuǎn)基因株系的莖生物量均高于對照組，生長優(yōu)勢最為顯著的為PEPC-3，其莖生物量為對照組的1.2倍，與之前株高測量的結(jié)果基本一致； 葉生物量優(yōu)勢明顯的依次是PEPC-3、PEPC-5和PEPC-4株系，分別高于對照組34.8%、15.4%和6.3%。生物量測定結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因植株光合作用的增強(qiáng)，但轉(zhuǎn)基因株系間差異顯著，優(yōu)勢最為明顯的為PEPC-3株系，且生物量的增長主要在莖和葉。

圖10 轉(zhuǎn)基因南林895楊和對照組的生物量Fig.10 Biomass of transgenic ‘Nanlin895’ poplars and control

3 討論

PEPC和PPDK是C4植物光合作用中的關(guān)鍵酶，直接關(guān)系到CO2固定和濃縮，在光合作用初級代謝階段發(fā)揮重要作用，C4植物具有的高效的光合作用主要是因?yàn)镻EPC及PPDK等關(guān)鍵的光合酶系統(tǒng)，使其在光能和CO2利用率以及抗光抑制性上更具優(yōu)勢(Tangetal.， 2017)。將C4植物PEPC和PPDK基因轉(zhuǎn)入到C3植物進(jìn)行表達(dá)被認(rèn)為是提高C3植物光合作用的重要手段，目前在水稻中已廣泛應(yīng)用，并有效地提高了水稻的光合能力及耐旱能力(Sethietal.， 2016)。將玉米PEPC基因構(gòu)建到秈稻當(dāng)中，PEPC酶能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植株葉片細(xì)胞對于CO2的固定能力，并能夠增強(qiáng)高溫條件下轉(zhuǎn)基因秈稻的光合能力(Bandyopadhyayetal.， 2007)； 水稻中過量表達(dá)玉米PEPC基因能夠降低高氧濃度對光合作用的氧抑制，該生理過程并非通過與CO2的高效結(jié)合完成，而是通過調(diào)控與O2結(jié)合水平實(shí)現(xiàn)，在此過程中，PEPC基因的表達(dá)影響了轉(zhuǎn)基因水稻植株內(nèi)2種參與糖類代謝的關(guān)鍵酶SPS和FBPase的合成(Agarieetal.， 2002)； 在轉(zhuǎn)PEPC+PPDK雙基因的水稻中，轉(zhuǎn)化基因能夠提高植株對CO2的固定和濃縮能力，加速光合循環(huán)，同時(shí)降低活性氧對質(zhì)膜的損傷，從而提高植株對水分的利用率及光合效率(姜蓓蓓等， 2018)。

綜上所述，外源PEPC和PPDK基因表達(dá)主要通過影響細(xì)胞對CO2結(jié)合及濃縮能力和相關(guān)下游基因的表達(dá)調(diào)控來提高轉(zhuǎn)基因植物的光合作用。本研究從玉米中克隆獲得的PEPC和PPDK基因與各自基因家族成員具有高度保守性，在PEPC基因編碼蛋白序列中，具有4個(gè)保守基序，能夠形成與羧化酶功能密切相關(guān)的典型裂縫結(jié)構(gòu)，PPDK基因編碼蛋白序列中具有3個(gè)參與催化功能的保守基序，且在2個(gè)蛋白中均存在保守的活性催化位點(diǎn)K和H。保守基序及保守功能位點(diǎn)的存在能夠推測玉米PEPC和PPDK基因在楊樹光合作用調(diào)控中發(fā)揮作用。另一方面，PEPC和PPDK序列分析結(jié)果表明，盡管研究中采用35S啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但在光照條件下，轉(zhuǎn)化基因表達(dá)量出現(xiàn)升高現(xiàn)象，推測與PEPC和PPDK基因中可能存在的調(diào)控元件有密切關(guān)系。克隆獲得玉米PEPC及PPDK基因序列中具有多種調(diào)控元件的編碼序列，如調(diào)控因子MYBCORE和WRKY710S等，光誘導(dǎo)型G-box、GATA-box等，以及熱敏型AT-rich及CATT-motif等，這些序列可能在不同條件誘導(dǎo)下發(fā)揮作用，影響啟動子活性，從而影響轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)特性(Chuetal.， 2002)，對轉(zhuǎn)基因楊樹光合作用調(diào)控發(fā)揮作用。同時(shí)，2個(gè)基因表達(dá)水平的差異可能與基因插入的拷貝數(shù)等因素有關(guān)。

通過對轉(zhuǎn)基因楊樹光合生理相關(guān)指標(biāo)測定結(jié)果分析，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因楊樹胞間CO2濃度在10:00—18:00期間明顯高于對照植株，在CO2濃度為0～700 μmol·mol-1的區(qū)間中，轉(zhuǎn)基因楊樹的光合響應(yīng)強(qiáng)度均呈線性增長，且高于對照組，同時(shí)CO2飽和點(diǎn)均低于對照組，表明與轉(zhuǎn)基因水稻相同，轉(zhuǎn)化的C4植物光合酶提高了楊樹對CO2的利用能力。C4途徑不僅能夠提供一個(gè)更高效的CO2濃縮機(jī)制，并能夠提高植物對水分和光照的利用效率，從而保障C4植物在干旱或強(qiáng)光環(huán)境下具有更高的光合效率(Liuetal.， 2017)。轉(zhuǎn)C4光合基因的作物也表現(xiàn)出相應(yīng)的優(yōu)勢。轉(zhuǎn)PEPC基因的水稻在PEG脅迫條件下較對照組有更好的耐旱能力(Qianetal.， 2015)； 在干旱條件下轉(zhuǎn)PEPC水稻氣孔關(guān)閉減少植物體內(nèi)水分流失，使轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐旱性，并在施加外源糖類物質(zhì)的條件下恢復(fù)氣孔導(dǎo)度，維持較高的光合水平(張金飛等， 2018)； 在水稻中過量表達(dá)PEPC基因能夠同時(shí)提高轉(zhuǎn)基因植株的耐旱能力和對高光強(qiáng)的耐受能力(Dingetal.， 2012)。與轉(zhuǎn)基因水稻相同，本研究中的轉(zhuǎn)基因南林895楊光合效率顯著高于對照組，主要是由于對強(qiáng)光的利用率明顯增強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因株系在中午時(shí)段凈光合速率高于對照組，以及第1峰推遲及單峰狀態(tài)都表明轉(zhuǎn)基因植株具有對高光照更強(qiáng)的耐受性。這與轉(zhuǎn)其他光合基因楊樹提高光合能力的途徑并不完全一致，例如轉(zhuǎn)PtRCA基因的楊樹通過提高耐光氧化性達(dá)到提高自身光合能力的目的(尹吳等， 2017)。另外與水稻等植物轉(zhuǎn)PEPC和PPDK基因的相關(guān)研究結(jié)果不同，本研究中轉(zhuǎn)基因楊樹的蒸騰速率較對照組并沒有表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，表明楊樹蒸騰速率在CO2濃度、空氣濕度、光照等多條件的影響下，并未因PEPC和PPDK基因的插入而出現(xiàn)顯著的變化。

玉米PEPC和PPDK基因的導(dǎo)入提高了轉(zhuǎn)基因南林895楊對CO2的固定能力和對于高光強(qiáng)的利用能力，與目前轉(zhuǎn)PEPC和PPDK基因植物的相關(guān)研究結(jié)果一致，并且最終體現(xiàn)為植物生長量優(yōu)勢；但轉(zhuǎn)基因南林895楊生物量增長與基因表達(dá)水平并不完全呈正相關(guān)，且在蛋白水平上，轉(zhuǎn)基因植株與對照組之間差異不顯著，可能與PEPC和PPDK基因下游產(chǎn)物的合成、翻譯水平的調(diào)控及翻譯后修飾有關(guān)(Ciereszkoetal.， 2001； Zhangetal.， 2018)，表明光合作用是一個(gè)多基因調(diào)控的生理過程，單個(gè)關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)化不能穩(wěn)定地形成生長優(yōu)勢，轉(zhuǎn)基因植株需要進(jìn)一步篩選優(yōu)化。

4 結(jié)論

玉米PEPC和PPDK基因的轉(zhuǎn)入能夠提高轉(zhuǎn)基因南林895楊的光合能力，用于轉(zhuǎn)化的玉米PEPC和PPDK基因具有其家族成員的典型保守基序和功能位點(diǎn)，使轉(zhuǎn)基因植株能夠增強(qiáng)對CO2的固定能力和對強(qiáng)光的利用能力，在光合生理參數(shù)上表現(xiàn)為影響轉(zhuǎn)基因植株的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、CO2飽和點(diǎn)等。另一方面，通過對植株生長性狀及生物量的測定，表明轉(zhuǎn)基因植株的生長在一定程度上優(yōu)于對照組，且轉(zhuǎn)PEPC基因株系明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)PPDK株系，轉(zhuǎn)基因植株光合能力的提高最終轉(zhuǎn)化為植物生長優(yōu)勢。