馬燕，孟伊娜，鄒淑萍，張謙，廖小軍，趙靚*

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆主要農(nóng)副產(chǎn)品精深加工工程技術研究中心，烏魯木齊 830091；2.中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，國家果蔬加工工程技術研究中心，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點開放實驗室，食品非熱加工北京市重點實驗室，北京 100083)

植物蛋白質(zhì)易被人體消化吸收，具有降低膽固醇、抗氧化和降血壓等生理保健功能[1]，因此植物蛋白的研究開發(fā)變得尤為重要。辣椒籽作為辣椒加工過程中的主要副產(chǎn)物，其含有豐富的蛋白質(zhì)(17.30%～19.83%)，可作為植物蛋白提取的主要來源[2]。國內(nèi)外對辣椒籽蛋白的提取主要采用溶劑脫脂法結合堿溶酸沉法和超聲輔助提取法[3，4]，堿溶酸沉法具有易操作、成本低、提取率和純度高等優(yōu)點，被廣泛用于工業(yè)化生產(chǎn)，因此優(yōu)化蛋白的提取參數(shù)對提高生產(chǎn)率具有重要的意義。馬燕等[5]采用高壓輔助溶劑法提取辣椒籽油，在料液比1∶10、提取壓力370 MPa、提取溫度50 ℃、提取時間5.7 min的條件下可得到高得率、低酸值、過氧化值、高碘值、不飽和脂肪酸、γ-VE和抗氧化能力的高品質(zhì)辣椒籽油，優(yōu)于溶劑和超聲提取籽油的品質(zhì)，對進一步研究高壓提油后辣椒籽粕蛋白的提取具有重要意義。前期研究發(fā)現(xiàn)高壓能夠改善大豆分離蛋白和白果分離蛋白的功能特性[6,7]，而采用高壓脫脂后的辣椒籽分離蛋白能否有效改善其功能特性仍有待進一步研究。目前尚未見高壓脫油結合堿溶酸沉法提取辣椒籽分離蛋白及其功能特性方面的研究報道。因此，本研究采用響應面法優(yōu)化高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取工藝，評價高壓脫脂辣椒籽分離蛋白功能特性的優(yōu)勢，旨在為后續(xù)產(chǎn)業(yè)化應用和高值產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)，同時提高辣椒加工副產(chǎn)物的綜合利用和附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

益都辣椒籽：由山東飛達集團有限公司提供。正己烷、氫氧化鈉、濃鹽酸、乙醇和磷酸等：均購于北京化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250：購于上海麥克林生化科技有限公司；牛血清清蛋白(BSA)標準品(98%)：購于Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司；大豆分離蛋白(純度≥85%)：購于北京索萊寶科技有限公司

1.2 主要實驗儀器

BSA822電子分析天平 Sartorius公司；XL-600B多功能粉粹機 永康市小寶電器有限公司；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式多用真空泵 上海秋佐科學儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；PB-10 pH計 德國賽多利斯公司；EMS-18A磁力攪拌器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；CR21GIII冷凍離心機 日本日立公司；SparkTM10M多功能酶標儀 瑞士TECAN公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 辣椒籽粉碎、脫脂處理

辣椒籽經(jīng)挑選、除雜后，與液氮以1∶1.5(W/V)放入粉碎機粉碎30 s，將辣椒籽粉粹、過60目篩，將過篩后的辣椒籽粉與正己烷按1∶10 (g/mL)混合、高壓脫脂密封置于4 ℃?zhèn)溆?。溶劑脫脂條件：料液比1∶10，提取溫度50 ℃，提取時間6 h，將溶劑脫脂后的辣椒籽分離蛋白密封置于4 ℃，用于后續(xù)功能性對比研究。

1.3.2 高壓辣椒籽主要成分的測定

辣椒籽的水分含量測定參照GB 5009.3-2016[8]的方法；灰分測定參照GB 5009.4-2016的方法[9]；油脂測定參考GB/T 5009.6-2016的方法[10]；蛋白質(zhì)測定參考GB 5009.5-2016的方法[11]；碳水化合物的測定參照Zhu等的方法[12]，按100%減去樣品的水分含量、灰分含量、脂肪含量及蛋白質(zhì)含量的總和。

1.3.3 高壓辣椒籽分離蛋白的提取工藝

采用堿溶酸沉法提取辣椒籽蛋白。高壓脫脂辣椒籽粉→堿溶→離心→等電點沉降→水洗至中性→冷凍干燥→辣椒籽分離蛋白→粉碎→真空包裝。

1.3.4 高壓脫脂辣椒籽分離蛋白的提取量

高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取量=高壓脫脂辣椒籽分離蛋白質(zhì)量/高壓脫脂后辣椒粉質(zhì)量。

1.3.5 高壓脫脂辣椒籽分離蛋白含量的測定

采用Bradford的方法對蛋白濃度進行測定[13]。分別吸取稀釋后的待測樣品50 μL置于酶標板孔內(nèi)，加入200 μL考馬斯亮藍混勻，靜置10 min，用酶標儀在595 nm處測定吸光值。根據(jù)標準曲線計算樣品中蛋白質(zhì)的濃度。

標準蛋白溶液的配制：將10.00 mg 牛血清蛋白標準品溶于10 mL磷酸鹽緩沖溶液中，配制成1.0 mg/mL的標準蛋白質(zhì)溶液，梯度稀釋成0.1～1 mg/mL的標準蛋白質(zhì)溶液。分別吸取50 μL配好的BSA標準溶液，加入200 μL考馬斯亮藍混勻，靜置10 min，在595 nm處測定吸光值。得到以蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光值為縱坐標的標準曲線(Y=6.9471X+0.0043，R2=0.9997)。

1.3.6 單因素實驗

1.3.6.1 pH的選擇

以料液比1∶20的比例加入蒸餾水，分別用0.5 mol/L NaOH 溶液和0.5 mol/L HCl溶液將提取液的pH值調(diào)整為7，8，9，10，11，12，在提取溫度40 ℃、提取時間20 min、3000 r/min離心20 min的條件下，測定上清液中分離蛋白含量。

1.3.6.2 料液比的選擇

選擇料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，用0.05 mol/L HCl溶液和0.05 mol/L NaOH溶液將提取液的pH 值調(diào)整為9，在料液比1∶20、提取溫度40 ℃、提取時間20 min、3000 r/min離心20 min的條件下，測定上清液中分離蛋白含量。

1.3.6.3 提取溫度的選擇

以料液比1∶35的比例加入蒸餾水，用0.05 mol/L HCl溶液和0.05 mol/L NaOH溶液將提取液的pH值調(diào)整為9，選擇提取溫度分別為20，30，40，50，60 ℃，在提取時間20 min、3000 r/min離心的條件下，測定上清液中分離蛋白含量。

1.3.6.4 提取時間的選擇

以料液比1∶35的比例加入蒸餾水，用0.5 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L HCl溶液將提取液的pH值調(diào)整為9，選擇提取時間分別為20，40，60，80，100，120 min，在提取溫度40 ℃、3000 r/min離心20 min的條件下，測定上清液中分離蛋白含量。

1.3.7 等電點的確定

將高壓脫脂辣椒籽堿溶蛋白溶液的pH值調(diào)整為3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，分別測定溶液中辣椒籽分離蛋白含量，確定辣椒籽分離蛋白等電點。

1.3.8 響應面優(yōu)化實驗

在單因素實驗基礎上，以高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取量為響應值，選取pH值、料液比、提取時間和提取溫度這4個因素作為對提取量影響較大的實驗因子進行響應面優(yōu)化，因素水平表見表1。

表1 響應面實驗因素和水平表 Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.9 高壓脫脂辣椒籽分離蛋白的功能特性

1.3.9.1 持水力的測定

參照 Mepba等的方法略作修改[14]。準確稱取0.10 g 樣品置于10 mL燒杯中，加入5 mL 蒸餾水后電磁攪拌24 h，然后以3500 r/min 離心10 min，棄去上清液后稱量樣品的質(zhì)量，測定公式如下：

持水力(g/g)=(m1-m0)/m0。

式中：m1為樣品濕質(zhì)量(g)；m0為樣品干質(zhì)量(g)。

1.3.9.2 持油力的測定

參照Mohammed等的方法略作修改[15]。準確稱取0.10 g 樣品置于10 mL 燒杯中，加入5 mL 植物油后電磁攪拌24 h，然后以3500 r/min 離心10 min，棄去上清液后稱量樣品的質(zhì)量，計算公式如下：

持油力(g/g)=(m1-m0)/m0。

式中：m1為樣品濕質(zhì)量(g)；m0為樣品干質(zhì)量(g)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel、SPSS 22.0進行方差檢驗、顯著性分析，采用Origin 9.2進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與圖表繪制，采用Design-Expert 11.00 進行響應面設計和分析、擬合與作圖，實驗所得數(shù)據(jù)均為3次實驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 高壓脫脂辣椒籽的主要成分

由表2可知，高壓脫脂辣椒籽中主要含有65.78%碳水化合物和22.80%蛋白質(zhì)，可作為植物蛋白質(zhì)提取的重要原料資源。

表2 高壓脫脂辣椒籽的主要成分Table 2 The main components of high-pressure defatted Capsicum seeds g/100 g

2.2 高壓脫脂辣椒籽分離蛋白質(zhì)的單因素實驗

2.2.1 pH對高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取效果的影響

由圖1可知，高壓脫脂辣椒籽分離蛋白的提取量隨著pH值的升高而增加，當pH值為7～9時，辣椒籽分離蛋白的提取量快速增加；當pH值大于9時，辣椒籽分離蛋白的提取量增加緩慢。這是由于隨著pH的升高，蛋白之間會產(chǎn)生靜電斥力和水合作用，阻止蛋白發(fā)生聚沉，有利于蛋白的溶解。但過高的pH值會使蛋白質(zhì)發(fā)生脫氨、脫羧基和水解等反應，導致蛋白質(zhì)變色和部分變性[16]。因此，選擇pH 9為較佳提取pH值。

圖1 pH對高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取量的影響Fig.1 Effect of pH values on the extraction yield of high-pressure defatted Capsicum seeds protein isolate

2.2.2 料液比對高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取效果的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，高壓脫脂辣椒籽分離蛋白的提取量逐漸升高，當料液比達到1∶35時，辣椒籽分離蛋白的提取量達最大值，隨后提取量的變化差異不顯著。這是由于隨著料液比的增加，提高了籽蛋白的溶解度，但當料液比達到一定比例時，蛋白的溶解度基本達到平衡，提取量將不再增加。因此，選擇1∶35作為較佳料液比[17]。

圖2 料液比對高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取量的影響Fig.2 Effect of ratio of solid to liquid on the extraction yield of high-pressure defatted Capsicum seeds protein isolate

2.2.3 不同提取時間對高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取效果的影響

由圖3可知，高壓脫脂辣椒籽分離蛋白的提取量隨著提取時間的延長而增加，當提取時間為40 min時，提取量達最高，之后隨著提取時間的下降提取率增加緩慢。這是由于在提取初期，辣椒籽分離蛋白沒有完全溶解，隨著提取時間的延長，辣椒籽分離蛋白的溶出量不斷增加，當溶出量增加到一定程度后，達到溶解平衡，即使再延長提取時間，也只有很少的蛋白質(zhì)溶出[18]。因此，選擇40 min為較佳提取時間。

圖3 提取時間對高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of high-pressure defatted Capsicum seeds protein isolate

2.2.4 不同提取溫度對高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取效果的影響

由圖4可知，高壓脫脂辣椒籽分離蛋白的提取量隨著提取溫度的增加而增加，當溫度達到40 ℃時，提取量達最高，這是由于當提取溫度較低時，水分子和蛋白質(zhì)分子不能充分進行相互作用，因而蛋白質(zhì)提取率較低，隨著溫度的升高，加快了分子擴散速率，有利于蛋白提取量的提高，當分子擴散逐漸達到平衡時，提取量將不再增加，但當溫度超過50 ℃時，提取量降低程度明顯，這可能是溫度升高到一定值時，導致部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性而產(chǎn)生聚集，減少蛋白溶出量，從而影響蛋白的提取量[19]。因此，選擇40 ℃作為較佳提取溫度。

圖4 提取溫度對高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of high-pressure defatted Capsicum seeds protein isolate

2.3 高壓脫脂辣椒籽分離蛋白等電點的確定

由圖5可知，當高壓脫脂辣椒籽分離蛋白在pH 4的條件下，溶液中的分離蛋白含量最低，即分離蛋白的提取量達最高。這說明蛋白質(zhì)在此pH條件下的正、負電荷數(shù)相同，凈電荷為零，因此確定蛋白溶液的pH 4為辣椒籽蛋白的等電點PI，這與李茉等對辣椒籽蛋白等電點的研究結果一致。

圖5 高壓脫脂辣椒籽分離蛋白的等電點Fig.5 Isoelectric point of high-pressure defatted Capsicum seeds protein isolate

2.4 響應面優(yōu)化實驗結果

2.4.1 回歸模型的建立及顯著性分析

在單因素實驗結果的基礎上，以高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取量為響應值，以pH(X1)、料液比(X2)、提取溫度(X3)和提取時間(X4)為自變量，采用Design-Expert 11.00統(tǒng)計分析軟件進行分析，建立了四因素三水平的中心組合實驗設計，結果見表3。

表3 響應面分析方案及結果Table 3 Design and result of response surface analysis

由表3可知，不同實驗條件的提取量范圍在4.48～7.08 g/100 g，通過對其進行多元回歸擬合，建立了高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取量(Y)與pH(A)、料液比(B)、提取溫度(C)和提取時間(D)的二次多項式回歸方程：

Y=6.58+0.12A+0.09B+0.25C+0.36D-0.07AB+0.63AC+0.03AD+0.17BC-0.21BD-0.27CD-0.54A2-0.77B2-0.58C2-0.65D2。

通過對回歸模型進行顯著性分析(見表4)，結果顯示模型中P=0.0004<0.0001，表明回歸模型極顯著失擬項，P=0.3981>0.1，表明失擬項不顯著，說明該模型的擬合程度良好，實驗誤差?。荒Ｐ椭械囊淮雾梄3、X4，交叉項X1X3和所有平方項影響顯著，各因素對提取量的影響依次為：相關系數(shù)R2為0.8781，說明模型能夠準確地與實驗數(shù)據(jù)擬合；模型變異系數(shù)≤10%，說明實驗精確度較高，該模型中的變異系數(shù)(C.V.)為6.14，具有較好的準確度，說明該回歸方程符合模型的建立，模型可以用來預測蛋白的提取條件。由自變量F值大小可知，各因素對高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取量的影響由大到小依次為：料液比>pH值>提取時間>提取溫度。根據(jù)表4中的顯著性檢驗結果，去除模型中的不顯著項，根據(jù)分層原理(hierarchy principle)保留A，B項[20]，得到簡化模型：

表4 回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結果Table 4 Regression model coefficients and significant test results equation

Y=6.58+0.12A+0.09B+0.25C+0.36D+0.63AC-0.54A2-0.77B2-0.58C2-0.65D2。

2.4.2 交互作用對提取量影響的響應面優(yōu)化

pH與溫度交互作用對提取量影響的響應面圖和等高線圖見圖6。

圖6 pH和溫度對提取量影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour of effect of pH and temperature on extraction yield

由圖6中a可知，辣椒籽分離蛋白提取量在設計范圍內(nèi)存在最大預測值和最佳點。在料液比1∶35，提取時間30 min的固定條件下，提取量隨著pH和堿溶溫度的增加而升高，當pH值達到9，提取溫度達40 ℃之后，提取量逐漸降低且增加不明顯，這可能是由于pH與提取溫度之間的交互作用。由圖6中b的等高線也可看出，pH與提取溫度之間存在較強的交互作用，這種相互作用的效應解釋了不同的pH和提取溫度對高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取量的顯著影響。

2.4.3 響應面優(yōu)化結果與驗證實驗

通過響應面優(yōu)化，得到辣椒籽分離蛋白的最佳提取工藝參數(shù)：pH為9.48，料液比為39.47 (g/mL)，提取溫度為36.50 ℃，提取時間為37.85 min，提取量為6.30 g/100 g?？紤]到實際生產(chǎn)，將最佳提取條件調(diào)整為：pH為9.5，料液比為1∶39，提取溫度為37 ℃，提取時間為38 min，為了檢驗結果的可靠性，對最佳條件進行了3次平行驗證實驗，得到高壓脫脂辣椒籽分離蛋白提取量為6.27 g/100 g，其相對誤差為0.03%，進一步驗證了模型預測值與實際值的擬合效果好，實驗優(yōu)化結果可行。將得到的分離蛋白采用凱氏定氮法進行測定，高壓脫脂辣椒籽分離蛋白的純度為90.29%。

2.5 高壓辣椒籽分離蛋白的功能特性研究

將最優(yōu)條件得到的高壓脫脂辣椒籽分離蛋白與溶劑脫脂辣椒籽分離蛋白的功能特性(持水力和持油力)進行對比，見圖7。

圖7 不同辣椒籽分離蛋白的功能特性Fig.7 The functional properties of different Capsicum seeds protein isolate

由圖7中a可知，高壓脫脂辣椒籽分離蛋白的持水力(3.10±0.14) g/g顯著高于溶劑脫脂辣椒籽分離蛋白的持水力(2.40±0.14) g/g，較脫脂辣椒籽分離蛋白的持水力提高了29.17%，持水力的增加可能是由于高壓處理增加了蛋白質(zhì)與水的接觸面積，使結構變得較為疏松，增強了蛋白分子網(wǎng)絡結構的形成，從而增加了持水性。由圖7中b可知，高壓脫脂辣椒籽分離蛋白的持油力(2.80±0.46) g/g顯著高于溶劑脫脂辣椒籽分離蛋白的持油力(2.00±0.11) g/g，較脫脂辣椒籽分離蛋白的持油分別提高了29.17%和40%，這可能是由于在非共價鍵的作用下，隨著高壓脫脂辣椒籽分離蛋白表面積的增加，持油力也增加。這說明辣椒籽分離蛋白具有較好的持水力和持油力，其功能特性明顯優(yōu)于脫脂辣椒籽蛋白。因此，高壓脫脂后的辣椒籽分離蛋白可作為一種新型食品添加劑或配料加入飲料、肉制品、面包和火腿腸等食品中來改善食品特性。

3 結論

采用響應面優(yōu)化法建立了辣椒籽蛋白二次回歸方程，并通過顯著性分析得到影響辣椒籽分離蛋白提取量的因素依次為：料液比>pH>時間>溫度；確定了辣椒籽的最佳提取條件：pH為9.5，料液比為1∶39，堿溶溫度為37 ℃，堿溶時間為38 min，提取量為6.27 g/100 g，最終得到的辣椒籽分離蛋白純度達90.29%，此法適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

高壓脫脂能明顯改善辣椒籽分離蛋白的持水力和持油力，其蛋白不僅可作為一種良好的食品添加劑添加到各種食品中，也可成為一種新型功能蛋白粉或者蛋白飲料產(chǎn)品新資源，為研發(fā)新產(chǎn)品、提高附加值、延長產(chǎn)業(yè)鏈提供了前期基礎。