李美萍，劉燕，張生萬，郭彩霞，尉立剛

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006)

細(xì)葉韭(AlliumtenuissimumL.)屬于百合科蔥屬多年生草本植物。其頂端花序細(xì)葉韭花(AlliumtenuissimumL. flowers，ATFs)，又被稱為麻麻花、摘麻花等，是北方地區(qū)傳統(tǒng)的調(diào)味品[1]，其傘形花序呈半球狀至球狀，較為松散，花為白色至淺紫色，花期主要在7～9月份[2]。將其自然風(fēng)干、油炸之后，香味獨(dú)特，深受人們喜愛。細(xì)葉韭花中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、還原糖等營養(yǎng)物質(zhì)[3]。此外，細(xì)葉韭花也是一種新型的藥食同源調(diào)味品，具有軟化血管、降血糖、降血脂等功效[4]。

近年來，人們對蔥屬植物的研究主要集中在對大蒜、洋蔥、大蔥的研究。Ebrahimzadeh等[5]發(fā)現(xiàn)大蒜具有自由基清除能力和抗溶血功效。馬利華等[6]比較了不同預(yù)處理后大蒜的品質(zhì)和抗氧化性。劉蘭等[7]利用高效液相色譜法對大蒜愈傷組織中的二烯丙基二硫進(jìn)行了分析檢測。Simin等[8]發(fā)現(xiàn)洋蔥中的多酚類物質(zhì)能夠有效清除自由基且具有抗炎效果。權(quán)美平[9]對洋蔥揮發(fā)油的成分及生物活性進(jìn)行了研究。李莎莉等[10]對洋蔥生物活性及其在食品中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。Sung等[11]發(fā)現(xiàn)大蔥提取物能夠有效降低肥胖小鼠的體重，并能減少脂肪積累；李肖等[12]對大蔥的生物活性及化學(xué)成分做了詳盡論述。而對細(xì)葉韭的研究主要集中在生物學(xué)特性、栽培技術(shù)、揮發(fā)性成分分析及精油提取等方面[13-16]，對細(xì)葉韭花醇提物的化學(xué)成分及抑菌作用的研究很少涉及。趙國萍等[17]認(rèn)為香辛料類物質(zhì)抗菌譜廣，采用酒精為溶劑的香辛料提取物對多種細(xì)菌均有強(qiáng)烈的抑制作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用乙醇作為溶劑，提取細(xì)葉韭花中的有效成分，利用高效液相色譜法測定細(xì)葉韭花醇提物的化學(xué)成分及含量；采用牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)測定提取物對枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌效果，以期找到最適的細(xì)葉韭花有效成分提取方法，為細(xì)葉韭花的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)：由山西大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g、pH 7.2～7.4。

1.1.3 材料與試劑

細(xì)葉韭：購自山西省朔州市。乙腈(色譜純)：Merck KGaA公司；娃哈哈純凈水；紫云英苷：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS124S分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；高效液相色譜儀 美國Waters公司；LS-75HD立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺 上海茸研儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)葉韭花醇提液制備

稱取粉碎并過80目篩的細(xì)葉韭花粉末10 g于250 mL的具塞錐形瓶中，按料液比1∶15加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，在40 ℃下浸泡30 min后經(jīng)減壓抽濾，得到的濾渣再次進(jìn)行提取，合并兩次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮成浸膏。用30%的乙醇溶解得到細(xì)葉韭花醇提液。

2.2 高效液相色譜條件

色譜柱為Agela Venusil XBP-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agela公司)，柱溫35 ℃，流動相A為乙腈，流動相B為水；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL，檢測波長260 nm。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution procedure of mobile phase

2.3 紫云英苷含量測定

精密稱取紫云英苷標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g，配制成100 μg/mL的母液；然后依次稀釋到10，20，30，40，50，60 μg/mL；按照2.2項下色譜條件進(jìn)樣測定，以紫云英苷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=63925.065x-560255.49，R2=0.9985。

2.4 菌懸液制備

取無菌水15 mL加入到培養(yǎng)24 h的枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌及金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基中，用滅菌的涂布器將菌液混勻，備用。

2.5 抑菌圈的測定

采用牛津杯法測定抑菌圈直徑。取滅菌、冷卻到45 ℃左右的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基15 mL，倒入已滅菌的平皿中，待冷卻凝固后，將制備好的枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌及金黃色葡萄球菌菌液分別取100 μL用涂布器涂布均勻。將滅菌的牛津杯在酒精燈上迅速灼燒后立即放置在涂菌后的平皿培養(yǎng)基上，輕輕按壓使其與培養(yǎng)基之間沒有空隙，分別向牛津杯中加入細(xì)葉韭花乙醇提取液0.1 mL，將平皿置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；對照組使用30%的乙醇溶液。測量抑菌圈直徑，取平均值，每株菌做3次重復(fù)。牛津杯實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)[18]：抑菌圈直徑>20 mm，極敏；16～20 mm，高敏；11～15 mm，中敏；8～10 mm，低敏；<8 mm，不敏感。

2.6 MIC、MBC的測定

依據(jù)文獻(xiàn)[19]并稍作修改。將滅菌的試管依次編號并加入細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 mL，向1號管中加入細(xì)葉韭花提取液1 mL，混勻，取1 mL至2號管中，依次到第5號管，棄去最后1 mL，然后向試管中加入1 mL菌液。第6號管只加菌液不加提取液作為陽性對照，第7號管只加細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為陰性對照，分別測定不同提取液對大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑制濃度。于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀測結(jié)果。當(dāng)陽性對照渾濁，陰性對照透明，實(shí)驗(yàn)組肉眼觀察無菌生長，無菌生長的最高稀釋濃度即為該提取液的MIC。從無菌生長的試管中吸取0.1 mL接種到普通培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落數(shù)少于5個視為無細(xì)菌生存，以無菌生長的最小濃度作為該提取物的MBC。為減少誤差，重復(fù)3次，取兩次結(jié)果相近的值作為最終值。

3 結(jié)果與討論

3.1 細(xì)葉韭花醇提物的高效液相色譜圖

在2.2的色譜條件下，得到提取物樣品和紫云英苷標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖，見圖1。

圖1 樣品與紫云英苷標(biāo)品的色譜圖Fig.1 Chromatogram of sample and astragalin

由圖1可知，在給定的色譜條件下細(xì)葉韭花醇提物得到了很好的分離，且主要有效成分與紫云英苷標(biāo)品出峰時間一致，認(rèn)為紫云英苷是細(xì)葉韭花醇提物的主要化學(xué)成分。同時按2.3項所建立的紫云英苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算乙醇提取物中紫云英苷含量，得到60%乙醇提取物的紫云英苷含量最高，達(dá)到9.67 μg/mg，結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度乙醇提取物中紫云英苷的含量Fig.2 Content of astragalin in different concentration of ethanol extracts

3.2 不同醇提物的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 不同濃度的乙醇提取物對3種菌的抑制作用

實(shí)驗(yàn)考察了30，40，50，60，70 mg/mL的濃度梯度下乙醇提取物對枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌性能，結(jié)果見表2。

表2 乙醇提取物對3種菌的抑制作用Table 2 Inhibition of ethanol extracts on the three kinds of bacteria

續(xù) 表

由表2可知，3種菌對細(xì)葉韭花醇提物顯示出不同的敏感程度，這與微生物的菌株和醇提物的濃度有關(guān)。對于3種細(xì)菌，提取物濃度在30 mg/mL時，60%、70%乙醇提取物對金黃色葡萄球菌為中敏，且60%乙醇提取物的抑制效果最強(qiáng)，達(dá)到12.08 mm；其余提取物對3種菌均為低敏。當(dāng)提取物濃度為40 mg/mL時，除80%、90%的醇提物外，其余提取物對金黃色葡萄球菌均為中敏；60%乙醇提取物對大腸埃希氏桿菌為中敏，其余提取物對枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌均為低敏。當(dāng)提取物濃度為50 mg/mL時，60%乙醇提取物對3種菌均為中敏，其余提取物對3種菌為中敏和低敏。當(dāng)提取物濃度為60 mg/mL時，提取物對金黃色葡萄球菌均為中敏。當(dāng)提取物濃度為70 mg/mL時，60%醇提物對金黃色葡萄球菌為高敏，抑菌圈達(dá)到16.03 mm；除90%醇提物對枯草芽孢桿菌抑菌、大腸埃希氏桿菌均為低敏外，其余提取物對3種菌均為中敏。

3.2.2 不同濃度60%醇提物的抑菌實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)考察了30，40，50，60，70 mg/mL的濃度梯度下60%乙醇提取物對枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌性能，結(jié)果見圖3。

圖3 不同濃度60%醇提物對3種菌的抑制作用Fig.3 Inhibition of different concentration of 60% ethanol extracts on the three kinds of bacteria

由圖3可知，細(xì)葉韭花60%乙醇提取物對3種菌的抑制效果隨著提取物濃度增大呈增加趨勢，且對金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯大于枯草芽孢桿菌與大腸埃希氏桿菌。當(dāng)60%醇提物的濃度為50 mg/mL時，對大腸埃希氏桿菌與枯草芽孢桿菌的抑制效果相當(dāng)，之后，隨著濃度的增大，提取物對枯草芽孢桿菌的抑制作用超過了對大腸埃希氏桿菌的抑制作用。

3.2.3 MIC、MBC實(shí)驗(yàn)結(jié)果

60%乙醇提取物對枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌及金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別見表3和表4。

表3 細(xì)葉韭花60%乙醇提取物的MICTable 3 MIC of 60% ethanol extracts from ATFs

表4 細(xì)葉韭花60%乙醇提取物的MBCTable 4 MBC of 60% ethanol extracts from ATFs

由表3可知，細(xì)葉韭花60%乙醇提取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及大腸埃希氏桿菌的MIC分別是35，17.5，35 mg/mL。

由表4可知，細(xì)葉韭花60%乙醇提取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及大腸埃希氏桿菌的MBC分別是35，17.5，35 mg/mL。

4 結(jié)論

采用乙醇作溶劑提取細(xì)葉韭花，通過高效液相色譜分析細(xì)葉韭花醇提物的化學(xué)成分，可知細(xì)葉韭花醇提物中主要含有紫云英苷，且60%乙醇提取物中的紫云英苷含量最高；紫云英苷化學(xué)名為山奈酚-3-葡萄糖苷，是廣泛存在于藥用植物中的一種天然類黃酮化合物，具有顯著的抗炎、抗氧化、抗過敏、抗菌等作用[20]。

細(xì)葉韭花不同濃度乙醇提取液對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌、枯草芽孢桿菌均有抑制效果，且隨著細(xì)葉韭花乙醇提取物濃度的增大，抑菌效果逐漸增強(qiáng)，尤以60%醇提物對上述3種菌的抑制效果最強(qiáng)，且對金黃色葡萄球菌的抑制作用大于對枯草芽孢桿菌與大腸埃希氏桿菌的抑制作用。由此可以推斷，細(xì)葉韭花醇提物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌、枯草芽孢桿菌起抑制作用的主要成分可能是醇提物中的紫云英苷，這一推斷與文獻(xiàn)[20]報道的紫云英苷的功效一致。