劉志平，李粉英，黃 桑，羅 力，陳遠(yuǎn)彬，何光范，曾昭智

[1.廣東藥科大學(xué)附屬第二醫(yī)院(廣州新海醫(yī)院)，廣東 廣州 510300；2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120；3.廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510006]

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種急性的重癥，在臨床并不少見(jiàn)。造成ALI的原因很多，根本原因是肺泡毛細(xì)血管的細(xì)胞膜因?yàn)槟承┰蛲ㄍ感栽龈撸鶎?dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)患者短時(shí)間內(nèi)死亡?，F(xiàn)有研究表明[1-5]，在患者的肺內(nèi)發(fā)生了多種由炎性因子和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的反應(yīng)，這些反應(yīng)在肺泡上皮細(xì)胞等作用下被逐級(jí)放大，炎性反應(yīng)也由此更為嚴(yán)重。而細(xì)胞因子本身的作用又是通過(guò)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用的，具有協(xié)同性和疊加性。現(xiàn)在已經(jīng)有了大量研究證明，ALI早期患者的肺中已經(jīng)出現(xiàn)了纖維化，這種纖維化的程度又直接影響了病情進(jìn)展，甚至能夠影響預(yù)后。因此，通過(guò)研究ALI中的炎性因子了解ALI纖維化是怎樣發(fā)生的，以及怎樣或采取何種藥物進(jìn)行干預(yù)，終極目的在于更好地治療ALI，抑或是開(kāi)辟預(yù)防ALI新途徑。遺憾的是目前并沒(méi)有特效藥物可以針對(duì)ALI進(jìn)行良好的治療。本研究選擇的藥物是丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉，以期從中國(guó)傳統(tǒng)藥物中尋找思路，使用大鼠與油酸，將大鼠誘導(dǎo)出現(xiàn)急性肺損傷纖維化之后再采用藥物進(jìn)行干預(yù)，采大鼠血液檢查白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和Ⅲ型前膠原(PCⅢ)，探討其可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)資料

1.1.1藥物與試劑：丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉注射液(上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1603102)，IL-1、TNF-α、PCⅢ ELISA檢測(cè)試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司，批號(hào)：201705)，油酸(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2016110142)，10%中性福爾馬林(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150303)。

1.1.2儀器：FA2004B電子天平(上海精科天美)，HZT-A1000電子天平(廈門(mén)華志)，RM2235切片機(jī)(德國(guó)徠卡)，AE2000倒置顯微鏡(廈門(mén)麥克奧迪)、HCP246恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)Memmert)，3K15冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA)，Infinite 200 pro酶標(biāo)儀(瑞士tecan)，血?dú)夥治鰞x(美國(guó) ABBOTT 公司)，F(xiàn)orma 902超低溫冰箱(美國(guó)Thermo)。

1.1.3動(dòng)物：本研究所用的均為雄性SD大鼠[由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(粵)2012-1125，合格證號(hào)SCXK(粵)2016-0041]，180～220 g購(gòu)買(mǎi)好實(shí)驗(yàn)用大鼠后，先將之飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2方法

1.2.1建立ALI 大鼠模型：全部大鼠共66只，將油酸一次性從尾靜脈注射進(jìn)入大鼠體內(nèi)，12 h后從大鼠的尾動(dòng)脈中取約0.2 ml血液監(jiān)測(cè)氧合指數(shù)，若達(dá)到PaO2/FiO2≤300就說(shuō)明造模成功，進(jìn)行下一步工作。

1.2.2分組及各自的處理：取沒(méi)有注射油酸的24只大鼠，自尾靜脈中注射與造模組等量的生理鹽水作為對(duì)照組。另外在建模成功的大鼠中選取48只，隨機(jī)平均分成兩組，其中一組為模型組，另一組為丹參酮治療組，在這兩組小鼠腹腔中以2 ml/kg的量注射生理鹽水。丹參酮治療組腹腔注射丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉注射液10 mg/kg，連續(xù)14 d每天進(jìn)行一次注射。于停藥第7天隨機(jī)處死12只大鼠，第14天時(shí)再次處死余下的12只，取相應(yīng)部位樣品檢測(cè)。

1.3觀察指標(biāo)：體重測(cè)定：給藥前、停藥第7天、停藥第14天。血?dú)夥治鰳悠罚捍笫髣?dòng)脈血，時(shí)間：給藥前、停藥第7天、停藥第14天。指標(biāo)：PaO2、PaO2/FiO2。肺指數(shù)、肺組織濕/干重測(cè)定時(shí)間：停藥第7天、停藥第14天；樣本：大鼠全肺，計(jì)算公式：肺指數(shù)=肺重(mg)/體重(g)。干重處理溫度：60 ℃，干重處理時(shí)間：72 h；濕/干質(zhì)量比(W/D)計(jì)算目的：肺水腫程度。用大鼠左肺。肺組織病理:停藥第7天、停藥第14天。固定液：10%福爾馬林；樣本：大鼠的右肺上葉，石蠟包埋切片后染色鏡檢。主要觀察指標(biāo)：肺泡水腫、間質(zhì)水腫、出血、肺不張、肺壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺充血、纖維化等。

1.4血清TNF-α、PCⅢ以及IL-1 含量測(cè)定：分別于停藥第7天和第14天大鼠動(dòng)脈采血3 ml，1 000 r/min離心10 min，分離取用血清，ELISA法測(cè)定TNF-α、PCⅢ以及IL-1水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對(duì)ALI大鼠體重的影響：丹參酮治療組的大鼠體重與其他兩組在停藥7 d和14 d后，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。提示丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉ALI大鼠體重?zé)o明顯影響。

表1 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對(duì)ALI大鼠體重的影響

2.2丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療處理后ALI大鼠血液PaO2及PaO2/FiO2結(jié)果變化：模型組及丹參酮治療組給藥前PaO2及PaO2/FiO2結(jié)果值均明顯低于正常對(duì)照組，證明ALI大鼠成功造模。停藥7 d和14 d后，丹參酮治療組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，明顯高于模型組大鼠，見(jiàn)表2。

表2 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對(duì)ALI大鼠血液PaO2及PaO2/FiO2結(jié)果變化情況

2.3丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療處理后ALI大鼠的肺指數(shù)、濕/干重比變化情況：停藥7 d和14 d后，正常對(duì)照組肺指數(shù)及濕/干重比均有不同程度降低，丹參酮治療組肺指數(shù)及濕/干重比均有不同程度降低，對(duì)比模型組而言，部分結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對(duì)ALI大鼠肺指數(shù)以及濕/干重比變化情況

2.4病理學(xué)結(jié)果

2.4.1肉眼觀察結(jié)果：模型組有肺水腫，肺表面出現(xiàn)血紅病變等癥狀，并且體積增大。丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉干預(yù)后，血紅病變減少，水腫等接近正常組。

2.4.2光鏡觀察結(jié)果：正常組肺泡腔無(wú)損壞，未見(jiàn)肺泡炎細(xì)胞、肺水腫、支氣管上皮變形、管周炎和支氣管纖維化。模型組鏡下未見(jiàn)肺泡腔，肺泡壁鏡下明顯增厚，可見(jiàn)較多炎細(xì)胞，可見(jiàn)明顯肺水腫，支氣管上皮嚴(yán)重變形，可見(jiàn)明顯纖維增生伴有肺結(jié)構(gòu)破壞。丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療后可見(jiàn)明顯的肺水腫好轉(zhuǎn)，支氣管變形情況消失，炎細(xì)胞明顯減少，纖維化程度大幅減輕，見(jiàn)圖1。

A：正常對(duì)照組：HE ×100

2.5丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對(duì)ALI大鼠血液TNF-α、PCⅢ以及IL-1 水平的影響：正常對(duì)照組和丹參酮治療組大鼠，相比模型組，在停藥7 d和14 d后，外周血中IL-1、TNF-α、PCⅢ水平均有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對(duì)ALI大鼠外周血中IL-1、TNF-α、PCⅢ水平的影響

3 討論

用油酸來(lái)制作ALI模型是得到了廣泛應(yīng)用的ALI研究模型之一，建模容易成功，結(jié)果過(guò)以滲出、炎性反應(yīng)和纖維增殖階段為特點(diǎn)[6-8]，早期即可觀察到肺纖維化。

本研究給大鼠注射了一定量的油酸，誘發(fā)了大鼠的肺充血水腫，出現(xiàn)炎性反應(yīng)，肺泡壁增厚，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并且發(fā)生明顯的肺損傷和纖維化，這些變化是對(duì)臨床上ALI纖維化進(jìn)程中病理變化的良好模擬。從PaO2/FiO2≤300及肺水腫、肺指數(shù)等指標(biāo)來(lái)看，造模后的大鼠都明顯高于正常對(duì)照[9]，表明進(jìn)行了成功的造模成功。經(jīng)丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療，可見(jiàn)明顯的肺水腫好轉(zhuǎn)，支氣管變形情況消失，炎細(xì)胞明顯減少，纖維化程度大幅減輕，同時(shí)能提高動(dòng)物血液中PaO2、PaO2/FiO2指數(shù)。

ALI纖維化過(guò)程中炎性變化有重要意義，IL-1、TNF-α等炎性因子促使大量中性粒細(xì)胞聚集于肺組織中，它們一般都黏附于肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上，誘發(fā)細(xì)胞釋放蛋白酶、氧自由基等，并且釋放更多炎性介質(zhì)等，損傷細(xì)胞，這些就是肺纖維化的病理基礎(chǔ)，由此可能發(fā)生的不僅僅是肺組織中毛細(xì)血管通透性增高，使得肺泡液伴隨大量蛋白質(zhì)滲出，還可能形成透明膜。PCⅢ是膠原纖維所特有的，可以用作機(jī)體組織纖維化的標(biāo)志物，其含量的變化與膠原的形成代謝有一定的相關(guān)性，因此用以判斷組織纖維化程度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在油酸誘導(dǎo)的ALI纖維化模型中TNF-α、PCⅢ以及IL-1 大量表達(dá)，再次證明了先前國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)研究成果[10-11]，經(jīng)丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療后，上述三種因子的水平顯著降低，可以解釋為丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉能夠有效保護(hù)ALI纖維化油酸大鼠肺模型，其方式有二，一是直接減少I(mǎi)L-1、TNF-α，二是通過(guò)降低PCⅢ，從而減少膠原蛋白沉積在細(xì)胞外基質(zhì)中，從而達(dá)到防治ALI纖維化的作用[12]。但本研究并沒(méi)有進(jìn)行信號(hào)通路的研究，所以也無(wú)法解釋到底哪種調(diào)節(jié)機(jī)制在疾病的形成中發(fā)揮了作用，因此需要后期實(shí)驗(yàn)室中更加完善的設(shè)計(jì)和更深入的研究來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。

綜上所述，丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉在某種程度上能夠有效治療油酸模型大鼠ALI纖維化，作用機(jī)制可能涉及了炎性因子的調(diào)節(jié)作用。但其對(duì)炎性因子水平調(diào)節(jié)機(jī)制和對(duì)信號(hào)通路的影響需做更進(jìn)一步的研究。