雷彩紅 張毅

肝纖維化是肝硬化早期病變狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞在肝纖維化進程中起到重要作用，被激活的肝星狀細(xì)胞在肝損傷部位激活、增殖并大量分泌I型膠原和III型膠原，從而加快了肝硬化進程[1]。普萘洛爾可用于治療肝硬化靜脈曲張破裂出血，有研究指出其在肝硬化治療中具有潛在應(yīng)用價值[2]。本研究通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，普萘洛爾具有抑制肝星狀細(xì)胞增殖、促進其凋亡的功效，同時還能夠降低肝星狀細(xì)胞I型及III型膠原的分泌，對延緩肝硬化進程具有重要意義，現(xiàn)詳述如下。

資料與方法

一、實驗材料

(一)主要儀器設(shè)備 thermo371型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國熱電公司) ； Ts2 NIKON相差顯微鏡(日本尼康有限公司)；TG16G臺式高速離心機 (江蘇億能有限公司)；賽多利斯 Practum124-1CN電子天平(德國賽多利斯公司)；Attune NxT流式細(xì)胞儀(Thermo Fisher有限公司)；ChemiScope Touch化學(xué)發(fā)光成像儀(中國勤翔有限公司)。

(二)主要試劑 胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM(美國Gibco公司)；鹽酸普萘洛爾片(中國藥品生物制品檢定所)；人I型膠原ELISA試劑盒(德國默沙克生物有限公司)；人III型膠原ELISA試劑盒(德國默沙克生物有限公司)

(三)研究對象 實驗選用肝星狀細(xì)胞購自空軍軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞庫。

二、試驗方法

(一)細(xì)胞復(fù)蘇及傳代培養(yǎng) 將凍存管取出后置入37℃的溫水中，不斷搖動直至凍存液融化，吸出凍存液并放入5 mL培養(yǎng)液，離心機離心5 min，棄去上清液后，于離心管中再加入5 mL培養(yǎng)液，吹打為細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃、5%二氧化碳條件下實施細(xì)胞培養(yǎng)，注意每日更換培養(yǎng)液；

觀察細(xì)胞鋪滿瓶底后，加入胰酶后使用顯微鏡進行細(xì)胞消化情況觀察，待細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隔增大后倒掉消化液，再加入5 mL血清細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打瓶壁上的細(xì)胞至其成為單細(xì)胞懸液，離心7 min，再次加入培養(yǎng)液吹打為新的單細(xì)胞懸液，并分裝入不同的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，實施傳代培養(yǎng)。

(二)細(xì)胞分組及干預(yù) 將肝星狀細(xì)胞分為5組，分別為對照組、生理鹽水組、A組、B組、C組，其中對照組加入細(xì)胞和培養(yǎng)液，生理鹽水組加入細(xì)胞、培養(yǎng)液和生理鹽水，A組加入細(xì)胞、培養(yǎng)液、10 μmol/L的鹽酸普萘洛爾，B組加入細(xì)胞、培養(yǎng)液、50 μmol/L的鹽酸普萘洛爾，C組加入細(xì)胞、培養(yǎng)液、100 μmol/L的鹽酸普萘洛爾，干預(yù)時間均為24 h，培養(yǎng)環(huán)境均為37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件。

三、觀察指標(biāo)及評測標(biāo)準(zhǔn)

(一)細(xì)胞形態(tài)變化 使用顯微鏡對5組細(xì)胞干預(yù)前后形態(tài)進行觀察，并進行前后及組間的對比；

(二)細(xì)胞增殖及凋亡情況 待細(xì)胞干預(yù)24 h后，加入10 μL的水溶性四唑鹽-1溶液再培養(yǎng)2 h，而后使用M2酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度，以此推斷細(xì)胞增殖程度，其原理為水溶性四唑鹽-1溶液可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為橙黃色，因而細(xì)胞增殖越快，則顏色越深，細(xì)胞增殖越慢，則顏色越淺；

細(xì)胞凋亡情況的測算選擇FACS法，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去細(xì)胞上層清液，使用無菌PBS沖洗兩遍后收集細(xì)胞沉淀，并使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

(三)細(xì)胞I型膠原及III型膠原濃度測定 采用ELISA法分別使用I型膠原及III型膠原試劑盒檢測5組細(xì)胞I型膠原及III型膠原濃度，每個指標(biāo)檢測3次，取平均值待用。

(四)MMP-2及TNF-α水平測定 MMP-2及TNF-α水平的檢測也采用ELISA法實施，待5組細(xì)胞干預(yù)24 h結(jié)束后使用試劑盒分別測定其濃度，每個值檢測3次，并取平均值待用。

(五)VEGF及PDGF水平檢測 VEGF及PDGF水平的檢測同樣采用ELISA法實施，待5組細(xì)胞干預(yù)24 h結(jié)束后使用試劑盒分別測定其濃度，每個值檢測3次，并取平均值待用。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、細(xì)胞形態(tài)變化

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，處理后對照組及生理鹽水組肝星狀細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)與干預(yù)前對比變化不大，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，貼壁良好，細(xì)胞間隙較小，較為緊密，細(xì)胞呈紡錘形或不規(guī)則形，大小均勻，胞漿豐富；而A、B、C三組細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞密度降低，貼壁不牢固，細(xì)胞間連接疏松，胞體變細(xì)長，且隨著普萘洛爾濃度的增加，細(xì)胞死亡現(xiàn)象愈加明顯。

二、細(xì)胞增殖及凋亡情況

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組與對照組相比增殖及凋亡無明顯變化(P>0.05)，A、B、C三組細(xì)胞均出現(xiàn)增殖降低，凋亡增加現(xiàn)象，與對照組相比差異明顯(P<0.05)，同時隨著普萘洛爾濃度的提升細(xì)胞增殖抑制及凋亡現(xiàn)象愈加明顯(P<0.05)，具體數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 5組細(xì)胞增殖與凋亡情況對比

三、不同組別細(xì)胞I型膠原及III型膠原濃度對比

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組與對照組相比Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原濃度差異不大(P>0.05)，而A、B、C三組Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原濃度明顯比對照組降低(P<0.05)，同時隨著普萘洛爾濃度的提升Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原濃度下降更為明顯(P<0.05)，具體數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 不同組別細(xì)胞I型膠原及III型膠原濃度對比

四、不同組別細(xì)胞MMP-2及TNF-α水平對比

經(jīng)檢測對比發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組與對照組相比MMP-2及TNF-α水平差異不大(P>0.05)，A、B、C三組MMP-2及TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，且隨著普萘洛爾濃度的提升下降幅度越大(P<0.05)，具體數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 不同組別細(xì)胞MMP-2及TNF-α水平對比

五、不同組別細(xì)胞VEGF及PDGF水平對比

經(jīng)檢測對比發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組與對照組相比VEGF及PDGF水平差異不大(P>0.05)，A、B、C三組VEGF及PDGF水平明顯降低(P<0.05)，且隨著普萘洛爾濃度的提升下降幅度越大(P<0.05)，具體數(shù)據(jù)如表4所示。

表4 不同組別細(xì)胞VEGF及PDGF水平對比

討 論

有研究結(jié)果指出，可以通過對肝星狀細(xì)胞病變進程的監(jiān)測來推測肝纖維化進程[3-5]。本研究就普萘洛爾通過PDGFR/Akt途徑抑制肝星狀細(xì)胞活化進而預(yù)防肝硬化的效果進行了探究，結(jié)果顯示，相比于未實施干預(yù)的對照組細(xì)胞及使用生理鹽水干預(yù)的生理鹽水組細(xì)胞，加用普萘洛爾干預(yù)的A、B、C三組肝星狀細(xì)胞其形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞密度下降、細(xì)胞間連接變疏松，同時A、B、C三組細(xì)胞的增殖程度均下降、凋亡率上升，I型及III型膠原濃度下降，MMP-2、TNF-α、VEGF及PDGF水平下降，相比于對照組及生理鹽水組差異明顯。通過分組干預(yù)可以發(fā)現(xiàn)，普萘洛爾能夠起到一定的抑制肝星狀細(xì)胞增殖、加快其凋亡、緩解炎性狀態(tài)的作用。本研究分析可通過以下途徑來對肝星狀細(xì)胞實施干預(yù)：(1)抑制肝星狀細(xì)胞增殖；(2)加速肝星狀細(xì)胞凋亡；(3)逆轉(zhuǎn)肝星狀細(xì)胞的活化，使其再次進入靜止?fàn)顟B(tài)；結(jié)果顯示，普萘洛爾的加入抑制了肝星狀細(xì)胞的活化，加速了其凋亡進程，同時進一步組間對比結(jié)果顯示，隨著普萘洛爾劑量的增加，肝星狀細(xì)胞增殖程度下降，凋亡率升高，這說明普萘洛爾確實具有潛在的抑制肝纖維化作用。本研究結(jié)果還提示普萘洛爾對I型膠原、III型膠原、MMP-2、TNF-α的分泌具有抑制作用，這與上文中炎性狀態(tài)會加快肝纖維化進程相呼應(yīng)。而對VEGF及PDGF水平的影響則解釋了普萘洛爾能夠抑制肝星狀細(xì)胞增殖的機制，其原因為普萘洛爾能夠通過PDGFR/Akt途徑來降低VEGF及PDGF水平，抑制新生血管的出現(xiàn)，進而起到緩解肝纖維化進程的作用。

總而言之，普萘洛爾具有抑制肝星狀細(xì)胞增殖、促進其凋亡的功效，同時還能夠降低肝星狀細(xì)胞Ⅰ型及Ⅲ型膠原的分泌，對延緩肝硬化進程具有重要意義。