陳寧 牛垚飛 佑航標(biāo) 占偉麗 吳賀文

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[1]，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。已有研究報道m(xù)iR-425在多種癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯升高，可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[2,3]。本研究旨在探討miR-425對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

(一)細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞系(MHCC-97H、SMMC-7721)和正常肝細(xì)胞系HL-7702由復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所提供，人肝癌細(xì)胞系HepG2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。所有細(xì)胞株生長在含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/mL)的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(二)主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒和實(shí)時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM購自大連Takara公司；miR-425 mimic、miR-425 inhibitor、陰性對照(NC)、干擾PTPRN2表達(dá)的質(zhì)粒(si-PTPRN2)和對照質(zhì)粒(si-NC)由上海吉瑪生物公司合成；Transwell小室和基質(zhì)膠購自美國BD公司；熒光素酶檢測試劑盒來源于美國Promega公司；實(shí)驗(yàn)所需的一抗和二抗購自美國Abcam公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-425 利用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒按照說明書進(jìn)行PCR。miR-425和內(nèi)參U6的引物由上海吉瑪生物公司設(shè)計并合成。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、70 ℃延伸10 s共40個循環(huán)，獲得Ct值，利用公式2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量。

(二)MTT實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染成功的對數(shù)期細(xì)胞使用胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸浮液并以每孔1000個細(xì)胞數(shù)接種到96孔板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24、48和72 h，每孔加入20 μL MTT并充分混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后緩慢吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，待結(jié)晶物質(zhì)充分溶解后，以空白孔調(diào)零，在Bioteck DR-3506全自動酶標(biāo)儀上測定波長為490 nm的吸光度(A)值。

(三)Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 首先將轉(zhuǎn)染后第2天的肝癌細(xì)胞用無血清的DMEM培養(yǎng)基制備成1×106個/ml的細(xì)胞懸液，然后在24孔板中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL，將Transwell小室放在孔上，吸取200 μL細(xì)胞懸液分別加入小室(遷移實(shí)驗(yàn))和鋪有基質(zhì)膠的小室(侵襲實(shí)驗(yàn))中。兩種實(shí)驗(yàn)的每組均設(shè)置3個復(fù)孔，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用棉簽輕輕地除去小室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結(jié)晶紫溶液對小室底部細(xì)胞進(jìn)行染色，于倒置顯微鏡下觀察、拍照并計數(shù)。

(四)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 首先將肝癌細(xì)胞HepG2接種于24孔板中，分3組：野生型質(zhì)粒組、突變型質(zhì)粒組和對照組，分別共轉(zhuǎn)染miR-425 mimic和野生型質(zhì)粒pGL3-PTPRN2 3′UTR Wt，共轉(zhuǎn)染miR-425 mimic和突變型質(zhì)粒pGL3-PTPRN2 3′UTR Mut，共轉(zhuǎn)染miR-425 mimic和對照熒光素酶質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后制備裂解物，利用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行熒光活性檢測，以海腎熒光素光吸收值作為內(nèi)參，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

(五)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 利用磷酸鹽緩沖液清洗待測肝癌細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液(含有蛋白酶抑制劑)提取細(xì)胞中的總蛋白，100℃ 5 min進(jìn)行變性。用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入PTPRN2一抗(1∶1 000)、內(nèi)參GAPDH一抗(1∶2 000)，4℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST充分清洗后加入發(fā)光液，最后利用凝膠成像儀進(jìn)行曝光、拍照并測定灰度值計算目的蛋白的表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-425在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

miR-425在正常肝細(xì)胞系HL-7702及不同肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H中的表達(dá)量分別為：1.00±0.03、2.01±0.13、3.97±0.24、9.14±0.26。與正常肝細(xì)胞相比，miR-425在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

二、封閉miR-425抑制肝癌細(xì)胞的增殖

與轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的MHCC-97H細(xì)胞相比，miR-425的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染miR-425 inhibitor組細(xì)胞中顯著下降(1.05±0.08比0.28±0.03)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明，miR-425 inhibitor可明顯降低MHCC-97H細(xì)胞中miR-425的表達(dá)。隨后利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測miR-425對肝癌細(xì)胞增殖情況的影響。如圖1所示，與NC組相比，miR-425 inhibitor組細(xì)胞的生長速度明顯減慢；培養(yǎng)72 h后MHCC-97H細(xì)胞的增殖能力顯著低于對照組(P<0.05)。由此可見，封閉miR-425的表達(dá)可明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

圖1 miR-425對肝癌細(xì)胞增殖的影響

三、封閉miR-425抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲

利用Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測miR-425對肝癌細(xì)胞MHCC-97H遷移和侵襲能力的影響。如圖2A所示，miR-425 inhibitor組遷移細(xì)胞數(shù)比NC組顯著減少(45±5比118±10，P<0.01)。如圖2B所示，miR-425 inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯少于NC組(32±5比94±8，P<0.01)。由此可見，封閉miR-425可明顯抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖2 miR-425對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

四、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-425與PTPRN2的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)預(yù)測miR-425種子序列可與PTPRN2 3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)配對結(jié)合，然后利用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者之間的靶向關(guān)系。與對照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-425 mimic和PTPRN2 3′UTR野生型質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低(0.99±0.09比0.40±0.03，P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染miR-425 mimic和PTPRN2 3′UTR突變型質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯變化(1.00±0.05比0.93±0.07，P>0.05)。如圖3所示，與對照組相比，miR-425 mimic組MHCC-97H細(xì)胞中PTPRN2蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。由此可見，miR-425可直接靶向結(jié)合PTPRN2并下調(diào)其蛋白表達(dá)水平。

圖3 miR-425對PTPRN2蛋白表達(dá)水平的影響

五、miR-425通過靶向PTPRN2影響肝癌細(xì)胞的增殖能力

封閉miR-425的表達(dá)后肝癌細(xì)胞MHCC-97H的增殖水平明顯受抑制，隨后在miR-425 inhibitor 組細(xì)胞中沉默PTPRN2蛋白表達(dá)，利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖水平是否可被逆轉(zhuǎn)。如圖4所示，miR-425 inhibitor+si-NC組MHCC-97H細(xì)胞的增殖能力明顯低于NC+si-NC組(P<0.05)；與miR-425 inhibitor+si-NC組相比，miR-425 inhibitor+si-PTPRN2組MHCC-97H細(xì)胞的增殖能力明顯升高(P<0.01)。結(jié)果表明，miR-425通過靶向下調(diào)PTPRN2的表達(dá)水平促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。

圖4 miR-425通過靶向PTPRN2影響肝癌細(xì)胞的增殖

六、miR-425通過靶向PTPRN2影響肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

封閉miR-425的表達(dá)后肝癌細(xì)胞MHCC-97H的遷移和侵襲能力明顯受抑制，隨后在miR-425 inhibitor 組細(xì)胞中沉默PTPRN2蛋白表達(dá)，利用Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力是否可被逆轉(zhuǎn)。如表1所示，miR-425 inhibitor+si-NC組遷移和侵襲肝癌細(xì)胞數(shù)均明顯低于NC+si-NC組(均P<0.01)，與圖2結(jié)果一致；與miR-425 inhibitor+si-NC組相比，miR-425 inhibitor+si-PTPRN2組遷移和侵襲肝癌細(xì)胞數(shù)均明顯增高(均P<0.01)。結(jié)果表明，miR-425通過靶向下調(diào)PTPRN2的表達(dá)水平促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

表1 miR-425通過靶向PTPRN2影響肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲(±s，n=6)

討 論

越來越多的研究表明，肝癌組織和細(xì)胞系中多種miRNA表達(dá)失調(diào)，通過調(diào)控某些癌基因或抑癌基因的表達(dá)水平，參與肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)miR-122a在肝癌組織和細(xì)胞系中均表達(dá)下調(diào)，通過靶向抑制細(xì)胞周期蛋白cyclinG1的表達(dá)可使肝癌細(xì)胞阻滯于S期[6]。Meng等[7]研究證實(shí)，miR-21在肝癌組織中明顯高表達(dá)，可通過靶向下調(diào)抑癌基因PTEN的蛋白表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程。Lin等[8]研究報道，在肝癌細(xì)胞系中miR-122的表達(dá)顯著下調(diào)，miR-122可抑制凋亡相關(guān)Bcl-2家族成員Bcl-w的蛋白表達(dá)，間接激活caspase-3從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-425在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于正常肝細(xì)胞；抑制miR-425 表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均明顯受到抑制。隨后，對于miR-425作用的靶基因及其發(fā)揮介導(dǎo)肝癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究。首先利用生物信息學(xué)軟件TargetScan和miRanda對miR-425作用的可能靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)合基因的已知功能，最終篩選出受體型蛋白酪氨酸磷酸酶N2(receptor-type tyrosine-protein phosphatase N2，PTPRN2)為其候選靶基因并作為進(jìn)一步研究的對象。

蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶參與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、代謝、基因轉(zhuǎn)錄和免疫應(yīng)答，在調(diào)控腫瘤生長過程中發(fā)揮重要作用[9]。已有研究表明， PTPRN2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的成員，在肺癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤呈現(xiàn)異常表達(dá)[10]，并與細(xì)胞凋亡存在密切聯(lián)系[11]。近年來有研究表明，PTPRN2可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和活力，發(fā)揮抑癌基因作用[12]。本研究表明，在肝癌細(xì)胞MHCC-97H中，miR-425可直接靶向作用于PTPRN2并負(fù)調(diào)控其蛋白表達(dá)。在肝癌細(xì)胞MHCC-97H中，利用小干擾RNA技術(shù)沉默PTPRN2蛋白表達(dá)后再次進(jìn)行細(xì)胞學(xué)功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制PTPRN2蛋白表達(dá)后，可逆轉(zhuǎn)封閉miR-425表達(dá)后的作用，使肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均明顯升高。