李明如，林貴湖，聶振凱，張凱華

中國(guó)航天科工集團(tuán)七三一醫(yī)院 胸外科，北京 100074

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200 nt不編碼蛋白質(zhì)的RNA，研究發(fā)現(xiàn)其在生物表觀遺傳調(diào)控過(guò)程中扮演重要角色[1]。癌癥的許多基因突變存在于不編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)，lncRNA的異常表達(dá)與不同的癌癥類型有關(guān)[2-4]。BLACAT1是一種lncRNA，最早發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。研究表明BLACAT1在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，并調(diào)節(jié)周期蛋白D1/CDKN2B軸抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖[6]。BLACAT1也可以作為海綿吸附miRNA，從而影響miRNA的表達(dá)量及生物學(xué)功能。BLACAT1通過(guò)靶向miR-361促進(jìn)ABCB1蛋白的表達(dá)，加速了胃癌對(duì)奧沙利鉑的耐藥，為胃癌的耐藥研究提供了新的思路[7]。

在此，我們圍繞BLACAT1的生物學(xué)功能，通過(guò)小干擾BLACAT1（si-BLACAT1）降低BLACAT1的表達(dá)量，研究對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響；并且，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)BLACAT1相互作用的miRNA為miR-374b-5p；結(jié)合BLACAT1與miR-374b-5p探討其對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、HCC827、NCIH1299、NCI-H23和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司；谷氨酰胺和100 mmol/L丙酮酸鈉溶液購(gòu)自Invitrogen公司；CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本東仁化學(xué)公司；Transwell購(gòu)自 Corning Costar公司；si-BLACAT1、si-NC 和miR-374b-5p mimics（模擬物）購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）引物、LipofectAMINE 2000購(gòu)自Invitrogen公司；MMP-2抗體、MMP-9抗體、E鈣黏蛋白抗體、N鈣黏蛋白抗體和二抗均購(gòu)自Abcam公司。

1.2 肺癌中BLACAT1的組織表達(dá)分析

采用starBase泛癌癥平臺(tái)挖掘癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)，分析肺癌組織與癌旁組織中BLACAT1的表達(dá)差異。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549和正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B采用DMEM培養(yǎng)基與FBS體積比為9∶1的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 HCC827、NCI-H1299和 NCI-H23采用 RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS、谷氨酰胺、100 mmol/L丙酮酸鈉溶液的體積比為88∶10∶1∶1的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，Nano?Drop檢測(cè)純度；用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩iR-374b-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物為5'-GT CGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCA CTGGATACGACCACTTAG-3'。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)

采用SYBR Green染料法檢測(cè)各細(xì)胞系中BLACAT1和miR-374b-5p的轉(zhuǎn)錄水平，qRT-PCR檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)NCBI官網(wǎng)公布的序列設(shè)計(jì)引物。BLACAT1正向引物為5'-ATCCCTGGA GGAAGTCGTCA-3'，反向引物為5'-CCCACGAGG AAAACCCTTGA-3'；miR-374b-5p正向引物為5'-ATATAATACAACCTG-3'，反向引物為5'-TGAGG TGCTGTGCGTGAC-3'；GAPDH正向引物為5'-GA AGGTGAAGGTCGGAGT-3'，反向引物為5'-GAA GATGGTGATGGGATTTC-3'；U6正向引物為5'-C TCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物為5'-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與細(xì)胞活力檢測(cè)

將細(xì)胞以1×104/孔接種到6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋度達(dá)50%～60%時(shí)，用LipofectAMINE 2000分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將分組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按5×103/孔接種到96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%～90%時(shí)棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入用不含血清培養(yǎng)基稀釋的10% CCK-8反應(yīng)液，將加入反應(yīng)液的96孔板于37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)40 min，取出96孔板，放入酶標(biāo)儀中檢測(cè)D450nm值。

1.7 細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè)

Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移，LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞按5×104/孔置于上室中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定后DAPI染細(xì)胞核，熒光顯微鏡拍照記錄，細(xì)胞遷移數(shù)目百分比計(jì)算細(xì)胞遷移率。侵襲實(shí)驗(yàn)用含基質(zhì)膠的Transwell上室接種轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞1×104/孔，下室加入含10%血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定后DAPI染細(xì)胞核，熒光顯微鏡記錄細(xì)胞侵襲能力，細(xì)胞侵襲數(shù)目百分比計(jì)算細(xì)胞侵襲率。

1.8 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將含miR-374b-5p結(jié)合位點(diǎn)的BLACAT1及Mut-BLACAT1插入pmir-GO構(gòu)建載體，用Lipo?fectAMINE 2000與miR-NC、miR-374b-5p mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后檢測(cè)螢火蟲螢光素酶和海參螢光素酶活性。相對(duì)螢光素酶活性為螢火蟲螢光素酶活性值/海參螢光素酶活性值。

1.9 轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

用胰酶消化轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心分離蛋白和細(xì)胞碎片，BCA法檢測(cè)細(xì)胞懸液中的蛋白濃度。樣品中加入上樣緩沖液，于100℃水浴鍋煮10 min，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。電泳結(jié)束后，恒流轉(zhuǎn)膜2 h。采用5%脫脂奶粉進(jìn)行蛋白封閉2 h，再與一抗4℃孵育過(guò)夜。一抗孵育完成后，加入二抗孵育1 h，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，通過(guò)凝膠成像儀觀察蛋白條帶結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 7.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次及以上，數(shù)據(jù)平均值用x±s表示，單因素獨(dú)立樣本數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，雙因素2組及以上采用雙因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，雙邊分析P<0.05表示有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

2 結(jié)果

2.1 BLACAT1在肺癌組織及癌旁組織轉(zhuǎn)錄水平差異

通過(guò)starBase分析BLACAT1在肺腺癌、肺鱗癌與癌旁組織的表達(dá)差異，樣本中有526例肺腺癌及59例癌旁組織，以及501例肺鱗癌及49例癌旁組織。結(jié)果顯示，BLACAT1在肺腺癌和肺鱗癌組織中的表達(dá)量均高于相應(yīng)癌旁組織（圖1），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

2.2 BLACAT1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系與正常肺上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平差異

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)BLACAT1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、HCC827、NCI-H1299、NCI-H23和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中的轉(zhuǎn)錄水平差異，結(jié)果見(jiàn)圖2，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中BLACAT1的轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B。比較幾組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞的BLACAT1表達(dá)量高于另外3組肺癌細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

圖1 BLACAT1在肺癌組織與癌旁組織中的差異表達(dá)

2.3 BLACAT1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活力影響

采用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒分析BLACAT1對(duì)A549細(xì)胞活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3，si-BLACAT1組A549細(xì)胞活力相比空白對(duì)照組明顯下調(diào)，并存在時(shí)間效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。結(jié)果表明敲低BLACAT1表達(dá)能明顯抑制A549的細(xì)胞活力。

2.4 BLACAT1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力影響

Transwell檢測(cè)BLACAT1對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。相比空白對(duì)照組，si-BLACAT1組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯下調(diào)，細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。結(jié)果表明敲低BLACAT1能夠明顯抑制A549細(xì)胞遷移和侵襲能力。

2.5 驗(yàn)證BLACAT1作為海綿吸附miR-374b-5p

圖2 qRT-PCR檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系

starBase軟件預(yù)測(cè)的肺癌中與BLACAT1存在相互作用的miRNA為miR-142-5p、miR-374b-5p、miR-378c和miR-20b-5p。qRT-PCR檢測(cè)空白對(duì)照組、si-NC組和si-BLACAT1組中各miRNA相對(duì)mRNA水平（圖5A），結(jié)果顯示，相比si-BLACAT1組各miRNA的mRNA水平，miR-374b-5p的mRNA水平明顯上調(diào)（P<0.001）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-374b-5p是否為BLACAT1海綿吸附的miRNA，采用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證空白對(duì)照組、miR-NC組和miR-374b-5p mimics組中相對(duì)螢光素酶活性（圖5B、C），結(jié)果顯示W(wǎng)T的miR-374b-5p mimics組相對(duì)螢光素酶活性明顯下調(diào)，說(shuō)明BLACAT1作為海綿吸附miR-374b-5p，降低其mRNA水平。

2.6 BLACAT1/miR-374b-5p對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活力的影響

采用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)BLACAT1/miR-374b-5p對(duì)A549細(xì)胞活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。相比空白對(duì)照組，p-BLACAT1組A549細(xì)胞活力明顯增加（P<0.001），miR-374b-5p mimics組A549細(xì)胞活力明顯降低（P<0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明BLACAT1通過(guò)抑制miR-374b-5p能夠增加A549細(xì)胞活力。

圖3 CCK-8檢測(cè)BLACAT1對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

2.7 BLACAT1/miR-374b-5p對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

采用Transwell培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察BLACAT1/miR-374b-5p對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（圖7A）。結(jié)果表明，相比空白對(duì)照組，p-BLACAT1組細(xì)胞遷移和侵襲能力均明顯上調(diào)，表現(xiàn)為熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；miR-374b-5p mimics組細(xì)胞遷移和侵襲能力均明顯下調(diào)，表現(xiàn)為熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；p-BLACAT1±m(xù)iR-374b-5p mimics組細(xì)胞遷移和侵襲能力沒(méi)有明顯差異。

采用Western印跡檢測(cè)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，p-BLACAT1組細(xì)胞MMP-2、MMP-9和N鈣黏蛋白明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），E鈣黏蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯差異（P=0.091）；miR-374b-5p mimics組細(xì)胞MMP-2、MMP-9和N鈣黏蛋白明顯下調(diào)，E鈣黏蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；p-BLACAT1±m(xù)iR-374b-5p mimics組細(xì)胞MMP-2和E鈣黏蛋白沒(méi)有明顯差異（P=0.416；P=0.998），MMP-9蛋白和N鈣黏蛋白的表達(dá)存在明顯差異（P<0.001；P=0.0017），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

以上結(jié)果表明BLACAT1通過(guò)抑制miR-374b-5p的表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞遷移和侵襲。

3 討論

圖4 Transwell檢測(cè)BLACAT1對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

圖5 驗(yàn)證BLACAT1作為海綿吸附miR-374b-5p

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率居前，確診的患者往往為癌癥晚期，轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，預(yù)后差[8-9]。傳統(tǒng)治療手段如手術(shù)、化療和放療治療效果有限，且化療和放療的副作用大，故選擇有效的補(bǔ)助治療手段成為亟待解決的問(wèn)題[10]。根據(jù)細(xì)胞來(lái)源不同及鏡下細(xì)胞形態(tài)，可將肺癌分為小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌為肺癌發(fā)病的主要類型，占85%[9]。非小細(xì)胞肺癌分為腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌[8]。BLACAT1作為一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA，在肺腺癌及肺鱗癌組織中高度表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，BLACAT1可以作為miRNA的靶點(diǎn)，與mRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相應(yīng)miRNA，從而降低miRNA的轉(zhuǎn)錄水平，提高該miRNA靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平[7]。

圖6 CCK-8檢測(cè)BLACAT1/miR-374b-5p對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

本研究目的為探究BLACAT1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的生物功能。體外培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，篩選BLACAT1高表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)549，研究BLACAT1對(duì)A549細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。為了進(jìn)一步探討B(tài)LACAT1的生物功能機(jī)制，利用軟件預(yù)測(cè)BLACAT1作為海綿吸附的miRNA，并驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，將BLACAT1與相互作用的miR-374b-5p結(jié)合，研究BLACAT1/miR-374b-5p對(duì)A549細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。最終證實(shí)BLACAT1通過(guò)抑制miR-374b-5p促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。miR-374b-5p作為miRNA家族一員，在人類腫瘤中被認(rèn)為是一種抑癌基因[11-13]。已有研究表明，miR-374b-5p表達(dá)下調(diào)與癌細(xì)胞耐藥相關(guān)，例如miR-374b-5p在功能上抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），并且增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[11]。miR-374b-5p被發(fā)現(xiàn)在胰腺癌組織中的表達(dá)與癌旁正常組織相比顯著降低，miR-374b-5p上調(diào)可改善胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性，并靶向多種抗凋亡蛋白，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]。

圖7 BLACAT1/miR-374b-5p對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

MMP-2、MMP-9、E鈣黏蛋白和N鈣黏蛋白均被證明與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，其中MMP-2、MMP-9和N鈣黏蛋白為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為易轉(zhuǎn)移細(xì)胞間質(zhì)表型的標(biāo)志物，E鈣黏蛋白為正常細(xì)胞表型的標(biāo)志物，當(dāng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型時(shí)，該蛋白的表達(dá)量降低[15-17]。本研究通過(guò)Western印跡檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在BLACAT1作用下，MMP-2、MMP-9和N鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)，E鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)；加入miR-374b-5p的回復(fù)實(shí)驗(yàn)則上調(diào)以上蛋白的表達(dá)水平。

綜上，可以將BLACAT1作為非小細(xì)胞肺癌治療的新靶點(diǎn)，抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。