李恒飛，肖明中，黃晶晶，徐 曦，呂 藝，彭 苗，黃大偉

(湖北省中醫(yī)院 肝病科，湖北 武漢 430074)

失眠是當(dāng)今社會發(fā)生率較高的疾病之一，入睡困難、睡眠質(zhì)量差會嚴(yán)重影響患者的日常生活，引發(fā)焦慮，嚴(yán)重者可導(dǎo)致抑郁，甚至產(chǎn)生自殺傾向。而住院病人的失眠發(fā)生概率較正常人明顯升高，尤其是慢性肝病病人，失眠發(fā)生率達(dá)50%以上[1-2]。

苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥是目前臨床應(yīng)用最廣泛的抗失眠藥物，具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠的作用，能有效緩解失眠癥狀，但其不良反應(yīng)也較多，除了常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制、宿醉作用，大劑量或長期應(yīng)用易致反跳性癥狀、耐受性、撤藥癥狀、成癮性外，由于其主要通過CYP450和葡糖醛酸結(jié)合代謝[3]，還可直接或間接導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，也可作為氧化劑或脂質(zhì)過氧化物引起慢性肝損傷[4]。因此，研究安全、有效的抗失眠制劑是我們需要解決的問題。

吳茱萸敷貼涌泉穴是湖北省中醫(yī)院肝病科的經(jīng)驗方，本方是基于中醫(yī)交通心腎理論，方用吳茱萸、酸棗仁、合歡皮磨成粉，加醋制成敷貼于人體涌泉穴，以溝通心腎、水火既濟(jì)。前期的臨床試驗已經(jīng)驗證吳茱萸敷貼在延長睡眠時間、提高睡眠質(zhì)量、減少日間功能障礙方面優(yōu)于艾司唑侖[5]。在前期研究基礎(chǔ)上，筆者通過腹腔注射PCPA誘導(dǎo)建立大鼠失眠模型，觀察吳茱萸敷貼涌泉穴對失眠大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，探討其治療失眠可能的作用機(jī)制，為臨床進(jìn)一步優(yōu)化應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠60只，SPF級，8周齡，雌雄各半，8周齡，體重150 ～180g，購自湖北省實驗動物研究所(合格證號：NO.42000600028700)。

1.2 主要藥物及試劑

對氯苯基丙氨酸(PAPC)購自酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司，批號EJ006530，在弱堿性環(huán)境下配制成懸混液。吳茱萸敷貼藥物組成為吳茱萸、酸棗仁、合歡皮，均購自湖北省中藥材公司，研磨成粉，以白醋配制成糊狀。艾司唑侖片購自湖北省中醫(yī)院。5-HT(5-羥色胺)、5-HIAA(5-羥吲哚乙酸)、NE(去甲腎上腺素)試劑盒均購自武漢拓捷生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

超低溫冰箱SANYC(-70 ℃、-20 ℃)；超低溫高速離心機(jī)(美國)二氧化碳孵育箱SHEL-LAB(美國)；高速臺式離心機(jī)L9L-10；酶聯(lián)免疫檢測儀CD3022A；水浴鍋TL-420D；光學(xué)讀數(shù)分析天平TG328B；高效液相色譜儀LC-4A(日本)；氣相色譜儀GL07A(日本)；紫外分光光度計WP；全自動組織切片機(jī)；全自動超薄切片機(jī)；超凈工作臺GHOI-I(國產(chǎn))。

1.4 動物分組及處理

將60只SD大鼠隨機(jī)分為6組，正常組、模型組、吳茱萸敷貼組、艾司唑侖組、吳茱萸敷貼+艾司唑侖組、生理鹽水對照組，每組10只。各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2天后，除正常組外，其余5組腹腔注射450 mg/kg的PAPC混懸液，連續(xù)注射2天，于第1次腹腔注射28～30 h后，大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天夜晚活動不停，表明模型復(fù)制成功。并于第3天開始給藥，吳茱萸敷貼組大鼠每天給予涌泉穴敷貼治療1次，每次貼敷時間為10min，連續(xù)敷貼5天；艾司唑侖組大鼠按0.92 mg·kg-1·d-1劑量給予艾司唑侖灌胃治療，連續(xù)5天；吳茱萸敷貼+艾司唑侖組大鼠每天給予涌泉穴敷貼治療1次，每次貼敷時間為10 min，同時按0.92 mg·kg-1·d-1的劑量給予艾司唑侖灌胃治療，連續(xù)5天；生理鹽水對照組大鼠連續(xù)5天給予等劑量生理鹽水灌胃；模型組大鼠除腹腔注射PCPA外不做任何處理。末次敷貼及灌胃后12 h，脫頸處死大鼠，取出下丘腦，在冰冷生理鹽水中洗去血液，組織稱重后，對5-HT、5-HIAA、NE進(jìn)行檢測。

1.5 指標(biāo)測定

分別采用Western Blot法、ELISA法檢測大鼠下丘腦內(nèi)5-HT、5-HIAA、NE的含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠造模后睡眠變化情況

于第1次腹腔注射PCPA 28～30 h后，大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天夜晚活動不停，表明模型復(fù)制成功。

2.2 各組大鼠下丘腦5-HT、5-HIAA、NE含量變化情況

與正常組比較，模型組、艾司唑侖處理組、吳茱萸敷貼治療組、吳茱萸敷貼+艾司唑侖組、生理鹽水對照組大鼠的5-HT、5-HIAA的含量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，艾司唑侖處理組、吳茱萸敷貼治療組、吳茱萸敷貼+艾司唑侖組大鼠5-HT、5-HIAA的含量明顯升高(P<0.01)。與艾司唑侖處理組比較，吳茱萸敷貼治療組、吳茱萸敷貼+艾司唑侖組大鼠5-HT、5-HIAA的含量也明顯升高(P<0.01)。與吳茱萸貼治療組比較，吳茱萸敷貼+艾司唑侖組5-HT、5-HIAA的含量明顯升高(P<0.01)。以上結(jié)果提示，吳茱萸敷貼的確能增加失眠大鼠下丘腦5-HT、5-HIAA的含量，且作用優(yōu)于艾司唑侖處理組；而吳茱萸敷貼聯(lián)合艾司唑侖的效果優(yōu)于單純運用吳茱萸敷貼，說明吳茱萸能增強(qiáng)艾司唑侖治療失眠的療效。見表1。

表1 各組大鼠下丘腦5-HT、5-HIAA含量變化比較

與正常組比較，模型組、艾司唑侖處理組、吳茱萸敷貼治療組、吳茱萸敷貼+艾司唑侖組、生理鹽水對照組下丘腦NE含量均顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，艾司唑侖處理組、吳茱萸敷貼治療組、吳茱萸敷貼+艾司唑侖組下丘腦NE含量顯著降低(P<0.01)。與艾司唑侖處理組比較，吳茱萸敷貼治療組下丘腦NE含量有所下降(P<0.05)，而吳茱萸敷貼+艾司唑侖組下丘腦NE含量則顯著降低(P<0.01)。與吳茱萸貼治療組比較，吳茱萸敷貼+艾司唑侖組下丘腦NE含量顯著降低(P<0.01)。以上結(jié)果說明，吳茱萸敷貼降低失眠大鼠下丘腦NE含量的作用優(yōu)于艾司唑侖處理組，而吳茱萸敷貼聯(lián)合艾司唑侖組則能使下丘腦NE含量得到進(jìn)一步的降低。見表2。

表2 各組大鼠下丘腦NE含量比較

3 討論

人類的睡眠過程依據(jù)腦電圖表現(xiàn)、眼球運動情況及肌張力變化可分為快速動眼睡眠(REM)和非快速動眼睡眠(NREM)，REM和NREM在睡眠過程中交替出現(xiàn)。5-HT又稱血清素，是人類發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的與睡眠覺醒有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)之一[6]。研究發(fā)現(xiàn)5-HT是促進(jìn)睡眠的重要神經(jīng)遞質(zhì)，腦內(nèi)高含量5-HT是睡眠發(fā)生必須的，而失眠病人常見5-HT降低[7]。5-HIAA是5-HT在細(xì)胞內(nèi)被單胺氧化酶降解后的代謝產(chǎn)物，由于5-HT被降解，檢測5-HT的含量不能完全反映五羥色胺能神經(jīng)元的興奮性，現(xiàn)在多用5-HIAA/5-HT(即 5-HT轉(zhuǎn)換率)作為反映五羥色胺能神經(jīng)元的興奮性的指標(biāo)[8]。腦內(nèi)的NE能神經(jīng)纖維主要集中在藍(lán)斑(LC)，在維持覺醒上具有重要作用，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)摧毀大鼠的藍(lán)斑頭部，大鼠覺醒狀態(tài)減少[9]。

吳茱萸敷貼由吳茱萸、酸棗仁、合歡皮加白醋調(diào)配而成。吳茱萸主入腎經(jīng)、心包經(jīng)，具有安神定志的效果，酸棗仁補(bǔ)心肝之陰血安神，合歡皮解郁安神，三者共奏安神定志、交通心腎之功，加入白醋有利于滲透皮膚。涌泉穴位于足底，為足少陰腎經(jīng)的井穴，常用于治療失眠等疾病[10]。本研究發(fā)現(xiàn)艾司唑侖組、吳茱萸敷貼組、吳茱萸敷貼+艾司唑侖組大鼠5-HT、5-HIAA含量較模型組上升，而NE含量下降，表明艾司唑侖灌胃和吳茱萸敷貼涌泉穴均可通過興奮五羥色胺能神經(jīng)元，抑制藍(lán)斑從而改善失眠。而吳茱萸敷貼組大鼠5-HT、5-HIAA含量較艾司唑侖組升高明顯，NE含量下降明顯，表明吳茱萸敷貼涌泉穴在促進(jìn)五羥色胺能神經(jīng)元興奮，抑制藍(lán)斑的作用上優(yōu)于艾司唑侖灌胃。吳茱萸敷貼+艾司唑侖組大鼠5-HT、5-HIAA含量上升水平及NE含量下降水平高于單用艾司唑侖組和吳茱萸敷貼組，表明二者具有協(xié)同作用。本研究表明吳茱萸敷貼涌泉穴治療失眠的效果優(yōu)于艾司唑侖，且二者合用具有協(xié)同效應(yīng)，作用機(jī)制可能是興奮五羥色胺能神經(jīng)元，抑制藍(lán)斑從而改善失眠。