劉治全 袁 虎 普雄明

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，石河子，832002;2湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長沙，410006;3新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊,830001

Kaposi肉瘤是一種罕見的低度惡性的血管肉瘤，病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[1]。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起到一定作用，并成為目前研究的熱點(diǎn)，miRNA已經(jīng)證實(shí)與Kaposi肉瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2-4]。lncRNA占非編碼RNA 80%以上，可能有比miRNA更復(fù)雜的作用，許多研究提示其可能成為腫瘤治療新的靶點(diǎn)[5,6]。本研究通過應(yīng)用高通量lncRNA芯片技術(shù)篩選出Kaposi肉瘤組織與瘤旁正常組織差異表達(dá)的lncRNA，聚類(GO)分析篩選出與Kaposi肉瘤相關(guān)的 lncRNA，為進(jìn)一步闡明Kaposi肉瘤的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年3～7月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科經(jīng)臨床和病理確診的5例Kaposi肉瘤患者瘤體和瘤旁正常皮膚組織，所有標(biāo)本一經(jīng)離體立即投入凍存管中，于液氮中保存。所有患者于取材前3個(gè)月未系統(tǒng)使用過免疫調(diào)節(jié)劑、糖皮質(zhì)激素等治療，且停止紫外線光療及外用藥物治療至少1個(gè)月；所有標(biāo)本均經(jīng)過2位高年資皮膚病理專家閱片證實(shí)。本研究獲新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均填寫卡波西肉瘤流行病調(diào)查表，并簽署知情同意書。5例Kaposi肉瘤患者中，男3例，女2例；年齡平均(57±20.34)歲；均為維吾爾族；均為經(jīng)典型Kaposi肉瘤。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 樣本組織總RNA的提取試劑 RNAiso Plus(TAKARA)，質(zhì)檢Bioanalyzer 2100(Agilent technologies)，RNA純化試劑盒RNeasy mini kit(QIAGEN)，cRNA合成和標(biāo)記試劑盒(Agilent technologies)，SYBR Green I(Takara)，紫外分光光度計(jì)ND-2000(NanoDrop)， ABI 7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)，lncRNA芯片雜交盒(Agilent technologie)，芯片掃描儀(Agilent technologies)。lncRNA芯片為上海伯豪公司的4×180 k human ceRNA表達(dá)芯片。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織總RNA的抽提和純化 取液氮凍存的Kaposi肉瘤和瘤旁正常組織，采用TAKARA RNAiso Plus并且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品的total RNA抽提，抽提所得total RNA質(zhì)檢合格后使用RNeasy mini kit和RNase-Free DNase Set進(jìn)行總RNA的純化。NanoDrop ND-2000紫外分光光度儀檢測(cè)樣本總RNA，樣本OD 260/280均在1.7～2.1，說明RNA純度高，28 S/18 S≥0.7/OD為合格，滿足芯片實(shí)驗(yàn)要求，見表1。

表1 測(cè)序樣本總RNA質(zhì)檢結(jié)果

1.3.2 芯片雜交、掃描及數(shù)據(jù)讀取分析 實(shí)驗(yàn)樣品RNA采用Low Input Quick Amp WT Labeling Kit和標(biāo)準(zhǔn)操作流程對(duì)樣品總RNA進(jìn)行放大和標(biāo)記，并用RNeasy mini kit純化標(biāo)記后的cRNA。按照Agilent表達(dá)譜芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和配套試劑盒Gene Expression Hybridization Kit組裝好雜交倉，將標(biāo)記后的樣本置于滾動(dòng)雜交爐中65℃，10 rpm，滾動(dòng)雜交17 h，雜交cRNA上樣量1.65 μg，并在洗缸中洗片，洗片所用的試劑為Gene Expression Wash Buffer Kit。雜交后的芯片采用Agilent Microarray Scanner進(jìn)行掃描。用Feature Extraction software 10.7讀取數(shù)據(jù)，最后采用R軟件中l(wèi)imma包進(jìn)行歸一化處理，分別繪制散點(diǎn)圖、火山圖和熱圖，并進(jìn)行GO分析和KEGG pathway分析。

1.3.3 qRT-PCR 用研磨儀將組織樣本研磨均勻，以Takara公司的RNAiso Plus提取總RNA，并用NanoDrop ND-2000紫外分光光度儀測(cè)定產(chǎn)物的濃度和純度。按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以人β-actin為內(nèi)參基因，用SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)在美國ABI 7500系統(tǒng)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)時(shí)采集熒光信號(hào)用ΔCt值代表基因的相對(duì)定量值，用 2-ΔΔCt值表示基因表達(dá)的差異倍數(shù)：ΔCt值=樣本基因的Ct值-同組β-action的Ct值，ΔΔCt值=各個(gè)樣本的ΔCt值-瘤旁正常組織的ΔCt值的平均值。引物序列：lnc-PXDN-3:3的上游序列ACCTTCCAGCCTTTGTCCTT，下游序列TACCCGAGCATCCACTTAGG；lnc-PERP-10:2的上游序列TCTCCCAGCCTCTCAAAACAG，下游序列AAACCAAGACCCTTCTACCTCTGA；β-action的上游序列TGACTTCAACAGCGACACCCA，下游序列CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本總RNA抽提質(zhì)檢結(jié)果 根據(jù)OD 260/OD 280(260 nm代表核酸的值，280 nm為蛋白質(zhì)的值)，該比值介于1.7～2.0時(shí)判定該樣本總RNA質(zhì)量合格。RNA Integrity Number(RIN)代表總RNA的完整性，RIN≥7.0為完整性好，RIN在6.0～7.0表示存在部分降解，RIN<6.0表示RNA降解。28S/18S≥0.7為合格。所有樣本RNA質(zhì)檢均合格。

2.2 lncRNA在Kaposi肉瘤中差異表達(dá)譜分析 通過lncRNA微陣列芯片檢測(cè)比較Kaposi肉瘤皮損及皮損旁組織之間差異表達(dá)的lncRNA表達(dá)譜。比較Kaposi肉瘤組織及正常組織中的lncRNA表達(dá)水平，將差異表達(dá)倍數(shù)≥1.5且P<0.05的lncRNA定義為差異表達(dá)lncRNA,結(jié)果篩選出差異表達(dá)lncRNA共717個(gè)，其中在Kaposi肉瘤組織中上調(diào)表達(dá)的lncRNA有408個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有309個(gè)。部分差異表達(dá)的lncRNA，見表2。

2.3 lncRNA差異表達(dá)聚類圖 lncRNA在Kaposi肉瘤組織標(biāo)本(group 1,g1)和瘤旁正常組織標(biāo)本(group 2,g2)中呈離散分布(圖1)。以差異倍數(shù)≥1.5且P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出Kaposi肉瘤組織與正常組織差異表達(dá)的lncRNA，其中紅色區(qū)域表示表達(dá)上調(diào)和藍(lán)色區(qū)域表示表達(dá)下調(diào)(圖2)。聚類分析直觀顯示每個(gè)樣本中不同lncRNA的表達(dá)水平，紅色表示高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，綠色表示低表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，灰色部分表示無顯著性差異，兩組樣本中l(wèi)ncRNA的表達(dá)存在差異(P<0.05)，見圖3。

2.4 qRT-PCR驗(yàn)證 為進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片結(jié)果，選取差異lncRNA：lnc-PXDN-3:3和lnc-PERP-10:2， 采用qRT-PCR在原有5對(duì)組織標(biāo)本中檢測(cè)lncRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致，每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，間接證明芯片分析數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性。見表3。

2.5 差異表達(dá)的lncRNA的靶基因預(yù)測(cè) 對(duì)于lncRNA靶向位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，我們先依據(jù)人類不同lncRNA數(shù)據(jù)庫，結(jié)合芯片注釋給出的lncRNA編號(hào)名稱以及坐標(biāo)，獲取差異表達(dá)的lncRNA序列。選取與lncRNA距離小于10 kb的基因作為順式作用元件(cis-elements)靶基因；再選出與差異表達(dá)的lncRNA序列具有互補(bǔ)性或相似性的序列，利用RNAplex計(jì)算兩序列之間的互補(bǔ)能量，選擇e≤-30的序列作為反式作用因子(trans-elements)作用靶基因，部分結(jié)果見表4。然后，根據(jù)生物信息學(xué)分析，對(duì)cis調(diào)控及trans調(diào)控的靶基因進(jìn)行KEGG通路注釋(圖4、5)。

圖1 Kaposi肉瘤和瘤旁組織差異表達(dá)的lncRNA散點(diǎn)圖

圖2 Kaposi肉瘤和瘤旁組織差異表達(dá)的lncRNA火山圖

表2 Kaposi肉瘤組織中部分差異表達(dá)的lncRNAs

圖3 Kaposi肉瘤組織與瘤旁正常組織差異表達(dá)的lncRNA聚類分析圖

表3 Kaposi肉瘤組織和瘤旁正常組織中2個(gè)lncRNA的表達(dá)差異

表4 Kaposi肉瘤組織部分差異表達(dá)的lncRNAs的靶基因預(yù)測(cè)

圖4 Cis靶基因富集KEGG通路分析圖 圖5 Trans靶基因富集KEGG通路分析圖

3 討論

Kaposi肉瘤是一種多發(fā)性特發(fā)性血管肉瘤，好發(fā)于雙下肢和足部的皮膚，內(nèi)臟少見，發(fā)展緩慢，臨床上分為四型：經(jīng)典型、艾滋病相關(guān)型(AIDS-KS)、非洲型和免疫抑制型。其病因未明，Kaposi肉瘤病毒感染(KSHV)是目前比較明確的病因之一，它編碼了12種成熟miRNA,其中kshv-mir-k12-1和kshv-mir-k12-12在Kaposi肉瘤組織中呈高表達(dá)[7]，kshv-mir-k12-1-5p可能通過靶向抑制CDKN1A 的表達(dá)影響Kaposi肉瘤的細(xì)胞周期。然而，不是所有感染KSHV者都會(huì)發(fā)生Kaposi肉瘤,人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒K(HERV-K)的活化可能起到了一定的促進(jìn)作用，而且并非所有的Kaposi肉瘤都存在KSHV感染[8]。Kaposi肉瘤發(fā)生有明確的地區(qū)分布和種族差異，在我國主要發(fā)生于新疆地區(qū)維吾爾族人群中，吳秀娟等[9]對(duì)該地區(qū)Kaposi肉瘤組織進(jìn)行miRNA芯片研究，發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的miRNA，進(jìn)一步研究提示miR-126可能是Kaposi肉瘤的一種抑癌基因。

目前研究表明有超過90%的人類基因組可以轉(zhuǎn)錄為RNA，但是其中只有2%可翻譯為蛋白質(zhì)，98%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為不編碼蛋白的非編碼 RNA，如miRNA、lncRNA等。近年來非編碼 RNA 成為研究的熱點(diǎn)[10]，而Kaposi肉瘤中的lncRNA與Kaposi肉瘤的關(guān)系研究較少。長鏈非編碼 RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長度超過200個(gè)核苷酸的線性非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，可通過順式(in cis)或反式(in trans)作用調(diào)節(jié)來調(diào)控靶基因的表達(dá)。近年來，越來越多的研究證實(shí)lncRNA在腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展的中發(fā)揮著重要作用[11-13]。

本研究通過lncRNA芯片分析了Kaposi肉瘤組織和正常組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的差異變化，按照表達(dá)差異倍數(shù)≥1.5倍且P<0.05進(jìn)行篩選，共得到717個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中在Kaposi肉瘤組織中上調(diào)409個(gè)，下調(diào)308個(gè)，與正常組織相比，Kaposi肉瘤組織中存在明顯的lncRNA差異表達(dá)，提示lncRNA可能參與了Kaposi肉瘤的發(fā)病過程。

利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示差異表達(dá)的lncRNA可能通過cis和trans兩種方式對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控。同時(shí)我們挑選了在Kaposi肉瘤組織中上調(diào)表達(dá)的lnc-PXDN-3:3和lnc-PERP-10:2通過qRT-PCR在5對(duì)樣本組織中進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。在Kaposi肉瘤lncRNA網(wǎng)絡(luò)的KEGG功能注釋中發(fā)現(xiàn)涉及到Wnt信號(hào)通路、泛素化代謝、TGF-β信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路是重要的細(xì)胞增殖、分化與凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路，與多種腫瘤密切相關(guān)。有研究證實(shí)乳腺癌中l(wèi)ncRNA CRNDE能通過競(jìng)爭抑制miR-136激活 Wnt/β-catenin信號(hào)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[15]，而lncRNA HIT對(duì)TGF-β介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移具有顯著的促進(jìn)作用[16]。胃癌組織中明顯低表達(dá)的lncRNA TUSC7，是 p53 的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，可以通過抑制 miR-23b 的方式來抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖[17]。也有研究顯示lncRNA可促進(jìn)蛋白泛素化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[18]。抑癌基因轉(zhuǎn)化生長因子II型受體(TGF-βRII)在Kaposi肉瘤瘤體中低表達(dá)，考慮與Kaposi肉瘤的發(fā)生有關(guān)[19]。Chudasama等[20]證實(shí)了KSHV的結(jié)構(gòu)蛋白能在裂解后期表達(dá)，并被整合到KSHV病毒顆粒中，抵抗p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。KSHV基因編碼的蛋白能直接或間接作用于多種信號(hào)通路，進(jìn)而參與病毒相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中[21]。因此，我們猜想本研究發(fā)現(xiàn)的lncRNA通過這些通路作用于KSHV或者Kaposi肉瘤瘤體本身，進(jìn)而影響Kaposi肉瘤的發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)初步探索lncRNA在Kaposi肉瘤中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究lncRNA在Kaposi肉瘤發(fā)病機(jī)制中的作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，后續(xù)我們將深入研究lncRNA在Kaposi肉瘤發(fā)病過程中的作用，為Kaposi肉瘤的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。