溫旭紅 張高峰 潘 倫 劉官智

四川省自貢市第四人民醫(yī)院皮膚科，自貢，643000

雄激素性脫發(fā)(androgenetic alopecia，AGA)是一種好發(fā)于中青年男性的最常見的脫發(fā)性疾病，發(fā)病率高，對(duì)患者心理、社交產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。目前AGA治療主要方法包括：(1)外用米諾地爾，通過(guò)開放細(xì)胞膜上K離子通道，產(chǎn)生血管舒張效應(yīng)；(2)口服非那雄胺，阻斷睪酮轉(zhuǎn)變?yōu)槎洳G酮從而減弱雄激素對(duì)毛囊的抑制作用；(3)口服西咪替丁、安體舒通等雄激素受體競(jìng)爭(zhēng)劑；(4)自體毛發(fā)移植。藥物常有不同程度的不良反應(yīng)如局部接觸性皮炎、多毛癥、性功能障礙、心肌梗塞和厭食等，并且不能阻斷病程，也無(wú)法誘導(dǎo)毛囊的再生，治療時(shí)間長(zhǎng)，停藥后常復(fù)發(fā)。而毛囊移植操作創(chuàng)傷大、毛囊存活率有限。因此尋找一種安全性高、可以促進(jìn)毛囊再生的方法一直是雄激素性脫發(fā)的研究熱點(diǎn)。

目前Yang等[1]研究發(fā)現(xiàn)在男性雄激素性脫發(fā)中，體重指數(shù)較高的人可能會(huì)有更嚴(yán)重的脫發(fā)，尤其是發(fā)病年齡較早的患者。并且AGA 受試者中血漿瘦素水平顯著高于非-AGA的受試者，且瘦素水平與嚴(yán)重程度成正相關(guān)[2]，但目前基礎(chǔ)研究中瘦素更多的被認(rèn)為是一種毛囊生長(zhǎng)期的誘導(dǎo)劑[3]。例如研究發(fā)現(xiàn)瘦素在毛乳頭細(xì)胞的退行期、靜止期和生長(zhǎng)期早期均有表達(dá)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，5周大的C57/BL6老鼠被毛毛囊已經(jīng)處于第一個(gè)生長(zhǎng)期的后期，但瘦素受體缺乏的db/db轉(zhuǎn)基因老鼠毛囊仍在第一個(gè)靜止期，而在7周大野生型老鼠剃毛的背部皮膚中注射瘦素20天后，注射區(qū)毛發(fā)生長(zhǎng)，而db/db轉(zhuǎn)基因老鼠局部注射瘦素未見毛發(fā)生長(zhǎng)[5]。瘦素水平在毛囊生長(zhǎng)期初期最低，在生長(zhǎng)期后期逐漸升高，靜止期階段中最高，也表明瘦素可能是毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期誘導(dǎo)劑[6]。糖皮質(zhì)激素及卵巢性激素均可刺激瘦素分泌,而雄激素則抑制其分泌[7]，同時(shí)有研究報(bào)道缺乏雄激素性受體老鼠會(huì)變得肥胖[8]。因此我們猜測(cè)AGA 患者由于局部雄激素增高、雄激素受體功能增強(qiáng)可能降低局部脂肪細(xì)胞中瘦素的表達(dá)，抑制了JAK2-STAT信號(hào)通路的活性，從而影響毛囊細(xì)胞的生長(zhǎng)周期及遷移等，最終導(dǎo)致 AGA患者出現(xiàn)脫發(fā)?；诖宋覀?cè)噲D通過(guò)外源性補(bǔ)充瘦素以達(dá)到治療雄激素性脫發(fā)的目的。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只C57雄性小鼠，體重 20～22 g，12周左右，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2015-030，動(dòng)物使用許可證：SCXK (川)2019-189。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 丙酸睪酮注射液(1 mL：25 mg，10支/盒，杭州動(dòng)物藥品廠)、5%米諾地爾酊(蔓迪，90 mL，浙江萬(wàn)晟藥物有限公司)、重組小鼠瘦素蛋白(CF，498-OB-05M，R&D system)、anti-GAPDH(abcam，EPR 16891)、anti-AR(abcam，AB 198394)、anti-Ki 67(abcam，ab 92742)、羊抗兔IgG(博奧森生物，bs-0295G-HRP)、羊抗鼠IgG(博奧森生物，bs-0296G-HRP)、全蛋白提取試劑盒(凱基生物，KGP 2100)、ECL化學(xué)發(fā)光液(博奧森，C 05-07004)、廣譜SP免疫組化檢測(cè)試劑盒(博奧森生物，SP-0022)、HE Staining Kit(博奧森生物，C 02-04004)、tunnel試劑盒(凱基生物,KGA7071)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 熒光顯微鏡(IX81，日本奧林巴斯)、Image-Pro Plus(Media Cybernetics, Silver Spring, MD，USA)、凝膠成像系統(tǒng)(UVP，EC 3300，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 實(shí)驗(yàn)將40只12周雄性C57小鼠按體重編號(hào)后隨機(jī)分組，空白組10只、模型組10只、米諾地爾組10只、瘦素組10只，飼養(yǎng)于溫度(23±2)℃，濕度(54±10)%環(huán)境，自由飲食、飲水。除空白組外，均選小鼠背部給與藥物皮下注射，均予以注射丙酸睪酮5 mg/kg·d，4周建模成功后，模型組僅繼續(xù)注射丙酸睪酮5 mg/kg·d，米諾地爾組予以注射丙酸睪酮5 mg/kg·d+外用5%米諾地爾酊0.2 mL/d，瘦素組予以注射丙酸睪酮5 mg/kg·d+重組小鼠瘦素20 μg，每日1次，再連續(xù)4周。

1.3 標(biāo)本獲取與處理

1.3.1 8周后肉眼觀察毛發(fā)生長(zhǎng)情況并行照相存檔。HE染色進(jìn)行毛囊形態(tài)調(diào)查：實(shí)驗(yàn)第8周結(jié)束時(shí)，留取各組小鼠背部脫發(fā)區(qū)皮膚約1 cm×1 cm后行組織HE染色，觀察小鼠毛囊形態(tài)學(xué)變化，100倍顯微鏡視野下，平均3個(gè)不重疊視野，1 mm皮膚長(zhǎng)度范圍內(nèi)利用Image-Pro Plus(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)測(cè)量毛囊長(zhǎng)度及大小，統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)期毛囊數(shù)量與休止期毛囊數(shù)量比值(A/T)。

1.3.2 Ki 67增殖及tunnel凋亡檢測(cè) (1)Ki 67免疫組化染色觀察毛囊細(xì)胞增殖情況：毛囊切片1%甲醛固定，常規(guī)脫水，包埋，切片，脫蠟復(fù)水，抗原修復(fù)，然后與兔抗小鼠Ki 67抗體(anti-Ki 67,ab 92742,abcam,USA)孵育，DAB顯色。(2)tunnel熒光染色觀察毛囊細(xì)胞中凋亡細(xì)胞碎片：通過(guò)抗地高辛配基異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔抗體顯示，用DAPI細(xì)胞核染色。Ki 67和tunnel的陰性對(duì)照組分別為省略兔抗小鼠Ki 67抗體或TdT-酶。每只隨機(jī)選取免疫組化切片，陽(yáng)性染色區(qū)，5個(gè)不重復(fù)視野，分別對(duì)毛囊上皮中陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行觀察，圖像分析Image-Pro Plus(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)分析積分光密度值，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.3 局部AR受體Western blot檢測(cè) 選取各組小鼠背部脫發(fā)皮膚，生理鹽水迅速?zèng)_洗，放入液氮中保存，采用凱基蛋白提取試劑盒提取全蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，室溫封閉120 min，一抗：兔抗鼠AR、兔抗鼠GAPDH室溫孵育30 min后4 ℃過(guò)夜，二抗羊抗兔1∶4 000室溫孵育1 h，暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)(UVP，EC3300，美國(guó))采集圖像并計(jì)算各組灰度值。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察脫發(fā)情況 8周后模型組較空白組相比脫發(fā)面積明顯增加，米諾地爾組及瘦素組與模型組相比脫發(fā)面積均明顯縮小，各組用藥區(qū)無(wú)紅腫、糜爛、滲出、潰瘍等情況，見圖1。

2.2 HE觀察各組生長(zhǎng)期/休止期毛囊數(shù)比例 8周后模型組較空白組生長(zhǎng)期/休止期毛囊數(shù)比值明顯降低(P<0.05)，米諾地爾組與瘦素組較模型組生長(zhǎng)期/休止期毛囊數(shù)比值明顯增加(P<0.05)，且米諾地爾組與瘦素組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖2、表1。

2.3 瘦素對(duì)毛囊細(xì)胞增殖作用的影響 模型組、米諾地爾組及瘦素組Ki 67表達(dá)均較空白組低(P<0.05),米諾地爾組及瘦素組較模型組相比Ki 67表達(dá)增高(P<0.05)，瘦素組與米諾地爾組相比Ki 67表達(dá)降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表2。

表1 各組A/T值

2.4 瘦素對(duì)毛囊細(xì)胞凋亡情況的影響 Tunnel結(jié)果顯示模型組凋亡細(xì)胞數(shù)量較空白組明顯增加(P<0.05)，米諾地爾組較空白組相比凋亡細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差別(P>0.05)，但較模型組相比凋亡表達(dá)減少(P<0.05)，瘦素組較空白組凋亡表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但較模型組凋亡表達(dá)同樣明顯降低(P<0.05)，且米諾地爾組與瘦素組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖4、表3。

1a:空白組;1b:模型組;1c:米諾地爾組;1d:瘦素組

2a：空白組以終毛為主；2b：模型組多見毛干直徑小、毛干色淺的休止期毛囊；2c、2d：米諾地爾組及瘦素組可見較多毛干顏色加深、毛干直徑大的生長(zhǎng)期毛囊

圖3 8周后各組小鼠脫發(fā)區(qū)Ki 67表達(dá)情況：模型組(3b)毛囊細(xì)胞Ki 67表達(dá)較空白組(3a)明顯降低，米諾地爾組(3c)及瘦素組(3d)Ki 67均為高表達(dá)(免疫組化，×100)

4a：空白組；4b：模型組；4c：米諾地爾組；4d：瘦素組

表2 各組Ki67表達(dá)情況

表3 各組凋亡表達(dá)結(jié)果

2.5 瘦素對(duì)雄激素性受體的影響 模型組、米諾地爾組及瘦素組較空白組相比AR受體表達(dá)升高(P<0.05)，但米諾地爾組與模型組相比及瘦素組與模型組相比，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖5、表4。

圖5 各組AR受體WB結(jié)果(A為空白組、B為模型組、C為米諾地爾組、D為瘦素組)

表4 各組雄激素受體表達(dá)結(jié)果

3 討論

瘦素(leptin)是一種16KD蛋白質(zhì)，它是一種激素或細(xì)胞因子，主要由脂肪細(xì)胞分泌，由肥胖基因(ob)編碼。在下丘腦中，瘦素與受體結(jié)合后發(fā)揮其主要效應(yīng)-抑制攝食行為，促進(jìn)代謝，調(diào)節(jié)全身能量平衡。因此目前將瘦素用于治療全身脂肪代謝障礙的1型糖尿病患者的有效性已有報(bào)道[9]。隨著脂肪生物學(xué)研究深入，人們發(fā)現(xiàn)皮膚和毛囊也可分泌瘦素，同時(shí)瘦素也可以通過(guò)多種途徑參與皮膚的生理病理過(guò)程，雖然瘦素對(duì)皮膚相關(guān)性疾病的治療作用目前仍處于空白，但關(guān)于瘦素及受體與皮膚及相關(guān)疾病的關(guān)系逐漸被報(bào)道。例如Cerman[10]及黃朝衛(wèi)等[11]研究證實(shí)重度銀屑病患者血清瘦素、組織中瘦素、瘦素受體表達(dá)明顯高于輕度、中度銀屑病患者及對(duì)照組。畢桂姣[12]發(fā)現(xiàn)天皰瘡患者血清瘦素水平增高、可溶性瘦素受體水平降低；曹瑛[13]研究糖尿病慢性潰瘍中皮膚組織 Leptin mRNA及OB-RL mRNA的基因表達(dá)水平均較正常皮膚組織減少可能是其愈合延遲原因之一。而在創(chuàng)傷中l(wèi)eptin和受體通過(guò)活化JAK/STAT通路等促進(jìn)角化細(xì)胞增殖，因此可以參與創(chuàng)傷愈合[14]。在免疫方面，瘦素受體均可在T細(xì)胞和B細(xì)胞上表達(dá)，瘦素可刺激T細(xì)胞增生和Th1反應(yīng),抑制T細(xì)胞凋亡，并可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子等參與免疫作用，因此在SLE、白塞病、銀屑病等均參與發(fā)生發(fā)展[15]。因此瘦素不僅僅是一種能量調(diào)節(jié)因子，也可以通過(guò)自分泌或者旁分泌方式通過(guò)促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)炎癥和免疫等影響皮膚衰老、創(chuàng)面愈合及毛囊的生長(zhǎng)。

毛囊作為皮膚重要附屬器官，具有周期性生長(zhǎng)的特點(diǎn)：生長(zhǎng)期、退行期、休止期，這種周期性的循環(huán)是由表皮細(xì)胞與真皮間充質(zhì)細(xì)胞相互作用的結(jié)果，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞與毛囊細(xì)胞間通過(guò)生長(zhǎng)信號(hào)相互交流，促進(jìn)了毛發(fā)周期循環(huán)[6]。真皮脂肪層厚度變化與毛囊的自然再生發(fā)生了同步變化：在毛囊生長(zhǎng)階段，皮內(nèi)脂肪細(xì)胞層擴(kuò)張，而靜止期脂肪層則變薄[16]。并且患有Goltz綜合征或局部真皮發(fā)育不全的患者，皮膚脂肪組織發(fā)生變化，同時(shí)伴有稀疏的、脆弱的頭發(fā)及局部脫發(fā)[17，18]。而缺乏皮膚脂肪組織或脂肪細(xì)胞功能障礙的小鼠表現(xiàn)出皮膚及毛發(fā)生長(zhǎng)的缺陷[19，20]。在治療方面，F(xiàn)ukuoka等[21]用培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞(ADSCs)的培養(yǎng)基用于治療脫發(fā)，可明顯誘導(dǎo)頭發(fā)生長(zhǎng)。此外，在萎縮性瘢痕性脫發(fā)患者中，自體脂肪移植能夠誘導(dǎo)眉毛再生，并在線形凹陷性萎縮性瘢痕和禿斑上取得顯著的臨床改善[22]。而David等[23]通過(guò)提取自體腹部脂肪，獲取富含脂肪基質(zhì)血管成分的細(xì)胞懸液后注射于雄激素性脫發(fā)患者頭皮脫發(fā)區(qū)，可以明顯促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。這些脂肪細(xì)胞對(duì)毛囊的影響一部分可能與前體脂肪細(xì)胞分化增殖相關(guān)，另一方面可能由于脂肪細(xì)胞分泌脂肪因子通過(guò)自分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育[15]。其中最重要的兩種脂肪因子為瘦素和脂聯(lián)素(adiponectin)。己有研究證實(shí)了瘦素和瘦素受體在人體及小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[24]、毛乳頭細(xì)胞[4]、毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘[25]等處均有表達(dá)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可以通過(guò)促進(jìn)毛發(fā)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖促進(jìn)體外培養(yǎng)的毛囊的毛干生長(zhǎng)，經(jīng)脂聯(lián)素處理的體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA表達(dá)明顯增加[26]。但瘦素對(duì)脫發(fā)性疾病的治療作用研究報(bào)道仍較少。

本研究顯示，局部注射瘦素可明顯促進(jìn)雄激素性脫發(fā)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)，脫發(fā)面積明顯減小，其治療效果與外用米諾地爾相當(dāng)，而HE染色提示瘦素組生長(zhǎng)期毛囊/退行期毛囊比例明顯增加，表明瘦素可誘導(dǎo)毛囊提前進(jìn)入生長(zhǎng)期或延長(zhǎng)生長(zhǎng)期。我們認(rèn)為以上治療效果可能與以下機(jī)制相關(guān)：(1)瘦素可通過(guò)激活JAK2-STAT3信號(hào)通路影響線粒體功能，増強(qiáng)線粒體活性，促進(jìn)細(xì)胞代謝，改善及恢復(fù)皮膚的修復(fù)再生功能，誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)創(chuàng)面愈合和毛發(fā)生長(zhǎng)循環(huán)[27，28]，我們實(shí)驗(yàn)中通過(guò)增殖及凋亡檢測(cè)也表明瘦素和米諾地爾均可抑制凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖代謝；(2)在小鼠被皮中，瘦素受體在隆突部位上皮(K15陽(yáng)性)處表達(dá)，且在靜止期及生長(zhǎng)期均有表達(dá)[6]，隆突部位為毛囊干細(xì)胞所在位置，瘦素可能與局部受體結(jié)合后通過(guò)影響毛囊干細(xì)胞分化、增殖或遷移，從而激活毛囊再生長(zhǎng)；(3)研究證實(shí)雄性激素受體(AR)表達(dá)增強(qiáng)的老鼠可通過(guò)阻止前脂肪細(xì)胞的分化[29]以及促進(jìn)脂質(zhì)合成[30]降低脂肪體積大小和重量，而我們研究中表明局部注射瘦素并不能抑制局部雄激素受體表達(dá)，但其是否與濃度相關(guān)還需要進(jìn)一步探索；(4)瘦素誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞的STAT3信號(hào)通路通過(guò)影響角質(zhì)形成細(xì)胞的分化、增殖、遷移等間接影響毛囊生長(zhǎng)[31]；另外也可通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子及激素水平等影響毛囊生長(zhǎng)分化。這些機(jī)制與既往治療雄激素性脫發(fā)機(jī)制有明顯不同。

綜上我們認(rèn)為瘦素可治療雄激素性脫發(fā)，且治療效果及藥物發(fā)揮作用與外用米諾地爾相當(dāng)，且瘦素是一種人體自身分泌的多效能因子，對(duì)機(jī)體更安全有效，我們?cè)诒巢烤植孔⑸涫菟剡^(guò)程中，小鼠背部皮膚無(wú)不良表現(xiàn)，小鼠未表現(xiàn)出消瘦、進(jìn)食減弱、活動(dòng)減少等情況，表明局部注射瘦素不足以影響小鼠全身激素代謝水平，而瘦素作用機(jī)制也許與誘導(dǎo)毛囊再生有明確相關(guān)性，這也許在維持雄激素性脫發(fā)治療效果上能獲得更為持久效果，因此調(diào)節(jié)自體瘦素分泌或外源性補(bǔ)充瘦素可能成為一種治療雄激素性脫發(fā)的新的安全、簡(jiǎn)單、有效的方法。