魯才娟 魯建央 詹欣 吳雅楓 翟洪波

結(jié)節(jié)性硬化癥（tuberous sclerosis complex，TSC）是一種累及多系統(tǒng)的常染色體顯性遺傳病，包括皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、眼睛、腎臟和肺[1]。發(fā)病率為1/（6 000～10 000）。約90%的患者并發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（癲癇、自閉癥和智力障礙），預(yù)后往往很差[2]。TSC1和TSC2基因突變與該疾病密切相關(guān)。在2012年國(guó)際TSC大會(huì)上，TSC1和TSC2基因突變被確定為獨(dú)立的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。近年來(lái)，隨著二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)的廣泛，部分單基因病的產(chǎn)前診斷成為可能。在本研究中，我們綜合應(yīng)用產(chǎn)前診斷超聲、家系全外顯子檢測(cè)、病理檢查對(duì)超聲提示心臟橫紋肌瘤的胎兒進(jìn)行了遺傳學(xué)分析，以明確其發(fā)病原因。

1 對(duì)象和方法

1.1對(duì)象 選擇2019年1月在本院遺傳咨詢門(mén)診的1例孕婦，27歲，孕26+4周。產(chǎn)前診斷超聲提示胎兒心臟多發(fā)橫紋肌瘤。對(duì)該胎兒及其父母行家系全外顯子檢測(cè)，同時(shí)對(duì)引產(chǎn)胎兒心臟組織行病理檢查。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所涉及引產(chǎn)胎兒及其父母的標(biāo)本均經(jīng)胎兒父母知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1 產(chǎn)前超聲檢查 使用美國(guó)GE Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率3.0～8.0 MHz。發(fā)現(xiàn)胎兒心臟腫塊后，探查腫塊形態(tài)、位置、數(shù)量及其與周邊關(guān)系，并對(duì)心臟結(jié)構(gòu)、功能等進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)隨診胎兒心率、心功能等變化。

1.2.2 家系全外顯子檢測(cè) 通過(guò)羊膜腔穿刺術(shù)采集羊水10 mL，4℃冰箱冷藏。父母外周血各5 mL（乙二胺四乙酸抗凝）。無(wú)菌條件下用DNA提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司)提取基因組DNA?；贗llumina二代測(cè)序平臺(tái)，采用Agilent SureSelectXTHuman All Exon V6 kit進(jìn)行捕獲建庫(kù)，利用雙末端（150 bp×2）測(cè)序的方法，完成樣本的全外顯子組測(cè)序，并進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。數(shù)據(jù)分析以GRCh37（hg19）基因組版本為依據(jù)，同時(shí)在1 000 Genomes Project，Genome Aggregation Database（gnomAD）；Exome Aggregation Consortium（ExAC）等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)該位點(diǎn)突變的意義。

1.2.3 病理檢查 孕32周時(shí)，家系全外顯子檢測(cè)提示TSC2基因雜合突變，孕婦及家屬要求優(yōu)生引產(chǎn)。引產(chǎn)胎兒心臟組織標(biāo)本用4%甲醛固定，常規(guī)石蠟制片，HE染色，行光鏡觀察，同時(shí)行免疫組化染色，抗體有Desmin、myoglobin、myogerdn、SMA，S-100。

2 結(jié)果

2.1產(chǎn)前超聲檢查結(jié)果 產(chǎn)前超聲提示胎兒右心房?jī)?nèi)大小約3.6 cm×2.7 cm×2.7 cm的實(shí)質(zhì)性高回聲團(tuán)（圖1A），左心室內(nèi)可見(jiàn)多個(gè)實(shí)質(zhì)性高回聲團(tuán)，較大3個(gè)分別1.5 cm×0.9 cm×0.9 cm，1.1 cm×0.8 cm×0.9 cm，0.6 cm×0.5 cm×0.4 cm（圖1B-D），邊界清，回聲均勻，無(wú)活動(dòng)性，血流動(dòng)力學(xué)未見(jiàn)明顯改變。超聲均未發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)、腎臟等其他部位結(jié)節(jié)性病變。

2.2家系全外顯子檢測(cè)結(jié)果 家系全外顯子檢測(cè)（封三圖2）提示胎兒TSC2基因雜合突變，c.1839+2_1839+9del8，經(jīng)典的mRNA剪接區(qū)域（外顯子±2bp區(qū)間），且核苷酸序列高度保守，較大概率導(dǎo)致氨基酸序列被改變，從而產(chǎn)生異常的蛋白質(zhì)。此變異未在相關(guān)臨床病例中報(bào)道過(guò)，亦未在OMIM、Clin-Var、1000 Genomes、ExAC及GnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道。父母檢測(cè)未攜帶該基因突變，為新發(fā)突變。

2.3病理結(jié)果 心臟經(jīng)甲醛固定后沿著大血管走形打開(kāi)心腔，于右心房及左心室內(nèi)見(jiàn)灰白色腫塊，邊界清晰，表面光滑，無(wú)包膜，切面呈灰白色、實(shí)性，質(zhì)地較嫩（封三圖3）。HE染色后鏡下觀察，瘤細(xì)胞大小不一，呈不規(guī)則形狀，胞質(zhì)呈清亮空泡狀（封三圖4A）。有些瘤細(xì)胞的嗜酸性胞質(zhì)由細(xì)胞核向細(xì)胞膜方向伸展，似蜘蛛，多數(shù)空泡樣變性，僅見(jiàn)稀疏的肌絲，稱為“蜘蛛樣細(xì)胞”[5]。腫瘤細(xì)胞形態(tài)溫和，無(wú)明顯異型性，未見(jiàn)核分裂象。行免疫組化染色腫瘤細(xì)胞myoglobin、myogerdn和Desmin（+），SMA、S-100（-）（封三圖4B）。

3 討論

心臟橫紋肌瘤是胎兒最常見(jiàn)的心臟腫瘤，占所有胎兒心臟原發(fā)腫瘤的60%～86%[6]。產(chǎn)前超聲作為早期發(fā)現(xiàn)心臟橫紋肌瘤的首要診斷方式[7]，表現(xiàn)為心腔內(nèi)及心包腔內(nèi)實(shí)質(zhì)性強(qiáng)回聲塊，邊界清晰，內(nèi)部回聲均勻，隨著心動(dòng)周期有一定活動(dòng)性。腫塊較小者無(wú)明顯血流動(dòng)力學(xué)改變，較大者可阻塞流入道或者流出道，阻塞處血流流速可明顯增高。通常，心臟橫紋肌瘤腫瘤對(duì)心臟功能的影響較小，只有少數(shù)胎兒表現(xiàn)出心臟并發(fā)癥。腫瘤可發(fā)生于心臟任何部位，以左心室和室間隔最常見(jiàn)，30%可累及心房和右心室[5]。橫紋肌瘤的檢出與孕周密切相關(guān)，孕中晚期檢出率明顯高于孕早期。本例孕婦在孕26+4周超聲發(fā)現(xiàn)。心臟橫紋肌瘤多發(fā)，最大者位于右心房，較一般的橫紋肌瘤大很多，左心室可見(jiàn)多個(gè)小腫塊。位置固定，活動(dòng)幅度低，未引起血流動(dòng)力學(xué)改變。該胎兒引產(chǎn)后，心臟組織行病理檢查。大體標(biāo)本為無(wú)包膜灰白色腫塊，大小不等，鏡檢可見(jiàn)特征性的“蜘蛛樣細(xì)胞”，行免疫組化亦證實(shí)為橫紋肌瘤。

心臟橫紋肌瘤與TSC密切相關(guān)，尤其是多發(fā)性心臟橫紋肌瘤是TSC的強(qiáng)烈預(yù)測(cè)指標(biāo)[8-9]。CHEN等[10]報(bào)道多發(fā)性橫紋肌瘤的胎兒中有93%具有TSC1或TSC2突變。而且單發(fā)性心臟橫紋肌瘤與TSC之間的相關(guān)性也很高，有71%的單發(fā)性心臟橫紋肌瘤胎兒TSC基因檢測(cè)呈陽(yáng)性。本病例因超聲提示胎兒多發(fā)心臟橫紋肌瘤，行家系全外顯子檢測(cè)，提示TSC2基因c.1839+2_1839+9del8移碼突變。這個(gè)變異位于經(jīng)典的mRNA剪接區(qū)域（外顯子±2bp區(qū)間），且核苷酸序列高度保守，較大概率導(dǎo)致氨基酸序列被改變，從而產(chǎn)生異常的蛋白質(zhì)。根據(jù)美國(guó)ACMG變異分類指南標(biāo)準(zhǔn)，為PVS1證據(jù)。同時(shí)，這個(gè)變異未在人群基因數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道，即人群頻率極低，為PM2證據(jù)。同時(shí)，通過(guò)家系檢測(cè)，及父母驗(yàn)證未攜帶該突變，考慮為新發(fā)突變，為PS2證據(jù)。但該位點(diǎn)在相關(guān)臨床病例中未見(jiàn)報(bào)道，也未行相關(guān)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)合送檢者的臨床表現(xiàn)和家系分析，依據(jù)美國(guó)ACMG變異分類指南，考慮為可能致病（PVS1+PM2+PS2）。TSC基因突變率高，Shruthi[11]等對(duì)98例TSC患者進(jìn)行TSC1和TSC2基因變異檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)14種新的錯(cuò)義變異,這些新變異的致病性均通過(guò)應(yīng)用不同的生物信息學(xué)工具，包括計(jì)算機(jī)輔助蛋白質(zhì)建模來(lái)確定。Lin等[12]對(duì)77例TSC患者的TSC1和TSC2基因進(jìn)行分析，共檢測(cè)到63例（81.8%）的突變，包括18個(gè)TSC1突變和45個(gè)TSC2突變，其中新發(fā)突變占14例。

圖1超聲提示胎兒心腔內(nèi)實(shí)質(zhì)性高回聲團(tuán)（A：右心房?jī)?nèi)實(shí)質(zhì)性高回聲團(tuán)；B-D：左心室內(nèi)實(shí)質(zhì)性高回聲團(tuán)）

圖3引產(chǎn)胎兒的心臟解剖圖片（可見(jiàn)多個(gè)橫紋肌瘤）

圖4橫紋肌瘤組織病理圖[A：HE染色后；B：免疫組化腫瘤細(xì)胞表達(dá)Desmin（+）]

TSC是一種常染色體顯性遺傳性疾病，由位于染色體9q34和16p13.3的TSC1基因或TSC2抑癌基因突變，影響Hamartin-Tuberin復(fù)合體功能，導(dǎo)致雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路過(guò)度活化[13-14]，臨床表現(xiàn)為錯(cuò)構(gòu)瘤導(dǎo)致的累及多系統(tǒng)的神經(jīng)皮膚病變。其中85%～95%的TSC患者可有腦損傷，存在室管膜下結(jié)節(jié)或室管膜下巨細(xì)胞星形細(xì)胞瘤；80%～90%可出現(xiàn)癲癇，約2/3為難治性癲癇，30%～40%有智力低下或自閉癥[15]。神經(jīng)和精神癥狀的發(fā)病率和死亡率最高[16]。TSC患者表現(xiàn)差異大，典型表現(xiàn)如面部血管纖維瘤、癲癇、智力低下等在患兒生后才會(huì)出現(xiàn)[17]。多數(shù)TSC患者如果不及時(shí)治療，預(yù)后不良。只有少數(shù)患者表現(xiàn)為輕癥并預(yù)后良好[18]。目前TSC尚缺乏有效的治療手段，也無(wú)法預(yù)測(cè)疾病的嚴(yán)重程度和病程。TSC在胎兒期的首要表現(xiàn)是心臟橫紋肌瘤[19]，而其他系統(tǒng)的異常在胎兒期表現(xiàn)不明顯或難以檢測(cè)，且檢測(cè)方法在胎兒期受到諸多限制。作為一種罕見(jiàn)病，全面的遺傳學(xué)分析，使我們能夠明確胎兒橫紋肌瘤與TSC之間的關(guān)系，這些信息可以幫助醫(yī)生制定圍生期管理策略并降低新生兒死亡率。心臟橫紋肌瘤胎兒的預(yù)后咨詢不僅應(yīng)包括腫瘤本身的預(yù)后，還應(yīng)包括橫紋肌瘤與TSC之間的關(guān)系以及TSC預(yù)后的信息，強(qiáng)調(diào)遺傳分析的重要性。該TSC2基因新的可能致病位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，不僅豐富了TSC基因數(shù)據(jù)庫(kù)，為T(mén)SC的遺傳學(xué)研究提供了新的依據(jù)。