宮青 魏玲 曲紅梅 趙洪芹

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266003； 2 威海市文登區(qū)人民醫(yī)院)

腦梗死是一種由環(huán)境和遺傳因素共同作用而引起的多基因疾病[1]。近年來(lái)，隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，腦梗死發(fā)病相關(guān)基因遺傳學(xué)研究也日益受到關(guān)注，尋找腦梗死相關(guān)致病基因已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[2]。骨保護(hù)素(OPG)是腫瘤壞死因子(TNF)超受體家族中的一種糖蛋白，同時(shí)也是TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的受體，是凋亡的有效激活因子[3]。王猛猛等[4]研究表明，OPG基因多態(tài)性與LAA型腦卒中易感性有關(guān)。CAO等[5]研究顯示，OPG基因rs3102735位點(diǎn)多態(tài)性與腦梗死的發(fā)生以及嚴(yán)重程度有關(guān)[6]，但是OPG基因多態(tài)性是否與血漿中OPG水平相關(guān)尚不明確。本研究旨在探討OPG基因多態(tài)性與血漿中OPG水平的關(guān)系，為進(jìn)一步探討OPG與LAA型腦梗死間的相關(guān)性提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年11月—2018年11月我院神經(jīng)內(nèi)科住院的LAA型腦梗死患者221例(LAA組)，患者均符合第四屆全國(guó)腦血管病會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)顱腦CT或MRI確診為腦梗死，并行頭頸部血管檢查，包括顱腦磁共振血管造影(MRA)和(或)頭頸部CT血管造影(CTA)或全腦血管造影(DSA)確診為頸內(nèi)動(dòng)脈或大腦中動(dòng)脈區(qū)腦梗死。按照經(jīng)典TOAST病因分型確定為L(zhǎng)AA型腦梗死[7]。入選標(biāo)準(zhǔn):責(zé)任血管動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄程度≥50%，患者均于發(fā)病72 h內(nèi)入院。排除標(biāo)準(zhǔn)：①由心源性栓塞、小血管型梗死、不明原因及其他原因?qū)е碌哪X梗死，如動(dòng)脈夾層、大動(dòng)脈炎、血液病、煙霧病、藥物等。②病情危重者；③近期使用了免疫抑制藥，有明顯的心、肝、腎功能不全以及急慢性感染、惡性腫瘤的患者；④近半個(gè)月服用了影響凝血功能的藥物或者既往有腦梗死病史者。選擇同期于我院體檢中心查體的健康者115例為對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn)：既往無(wú)腦梗死病史，顱腦CT或MRI檢查示無(wú)急性期腦梗死；血管檢査無(wú)明顯顱內(nèi)外動(dòng)脈粥樣硬化及狹窄的證據(jù)。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(QDDXYXYFSXY-2014-005)，所有研究對(duì)象及家屬均了解研究目的并簽署知情同意書(shū)。

1.2 樣本采集和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

清晨空腹采集所有受試者的前臂靜脈血8 mL，4 mL血液以3 000 r/min離心10 min分離血漿，將血漿轉(zhuǎn)移到聚丙烯管中，于-70 ℃凍存待測(cè)OPG濃度。血漿中OPG濃度采用人OPG ELISA試劑盒(R&D System公司，美國(guó))測(cè)定。檢測(cè)間和檢測(cè)內(nèi)變異系數(shù)分別為5.7%和4.9%。另外4 mL靜脈血以3 000 r/min離心15 min后分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀(北京泰林東方商貿(mào)有限公司)檢測(cè)受試者血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、葡萄糖(GLU)、三酰甘油(TG)水平。

1.3 基因擴(kuò)增

采用標(biāo)準(zhǔn)方法提取受檢者外周血白細(xì)胞基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)OPG基因多態(tài)性。以GenBank為參考基因序列，由北京圣工股份有限公司設(shè)計(jì)并且合成引物。使用美國(guó)Applied Biosystems 2720PCR擴(kuò)增儀，TaKaRa LA Taq with GC緩沖液反應(yīng)試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體系25 μL,包括DNA模板4 μL，LA Taq酶1 μL，及2×緩沖液12.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，10 μmol/L上下游引物各0.6 μL,加雙蒸水至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

1.4 基因型鑒定

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4 μL，加入限制性內(nèi)切酶AseⅠ(新英格蘭生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京) 1 μL和緩沖液2.5 μL，加雙蒸水至8 μL，于37 ℃恒溫水浴1 h，然后進(jìn)行電泳。使用Tanon 4200 SF 全自動(dòng)熒光/化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)觀察PCR擴(kuò)增情況并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 OPG基因rs3102735位點(diǎn)多態(tài)性的酶切電泳結(jié)果

OPG基因rs3102735位點(diǎn)多態(tài)性的酶切電泳結(jié)果見(jiàn)1圖，TT型被酶切為161、139 bp 2個(gè)片段；CC型不能被酶切，片段長(zhǎng)度為300 bp；CT型被酶切為300、161和139 bp 3個(gè)片段。

①、②、③分別為基因型CT、CC、TT，M為Marker

2.2 對(duì)照組和LAA組一般臨床資料比較

LAA組和對(duì)照組年齡、性別、糖尿病構(gòu)成比、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CAD)構(gòu)成比及LDL-C、TG、TC水平相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LAA組高血壓、吸煙、飲酒的發(fā)生率及OPG表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.488～5.890，t=4.826，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組和LAA組一般資料比較

2.3 兩組OPG基因rs3102735位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，兩組OPG基因rs3102735位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布均處于遺傳平衡狀態(tài)(P>0.05)。由于rs3102735位點(diǎn)的C等位基因分布較少，所以將CC和CT基因型合并后進(jìn)行基因型分析。LAA組CC/CT基因型和C等位基因分布頻率明顯高于對(duì)照組(χ2=6.408、8.903，P<0.05)。在調(diào)整混雜因素(高血壓、吸煙、飲酒)后，CC/CT基因型、C等位基因與LAA型腦梗死的發(fā)生呈顯著相關(guān)(OR=1.574，95%CI=1.063～3.154，P<0.05，OR=1.633，95%CI=1.182～2.665，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組OPG基因rs3102735位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較

2.4 兩組OPG基因rs3102735位點(diǎn)基因型與血漿OPG水平的關(guān)系

LAA組CC/CT基因型及C等位基因患者血漿中OPG表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(χ2=5.377、6.872，P<0.05)。在調(diào)整混雜因素(高血壓、吸煙、飲酒)后，CC/CT基因型、C等位基因與高OPG水平有關(guān)(OR=1.002，95%CI=1.001～1.0003，P<0.05；OR=1.572，95%CI=1.019～2.425，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組OPG基因rs3102735位點(diǎn)基因型與血漿OPG水平的關(guān)系

3 討 論

研究顯示，OPG可通過(guò)抑制某些黏附趨化因子的表達(dá)上調(diào)和血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡來(lái)發(fā)揮血管保護(hù)作用[8-9]。研究表明，血漿中OPG水平與動(dòng)脈粥樣硬化、腦梗死的發(fā)生及其嚴(yán)重程度有關(guān)[10-13]。本研究結(jié)果顯示，LAA組血漿OPG水平顯著高于對(duì)照組，提示血漿OPG水平增高可能與LAA型腦梗死的發(fā)病相關(guān)，與先前的研究結(jié)果一致[14-17]。腦梗死患者血漿中OPG水平增高的原因可能與OPG參與腦梗死急性期炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和斑塊不穩(wěn)定等有關(guān)[18-20]。

OPG基因位于染色體8q23-24上，rs3102735多態(tài)性位點(diǎn)位于啟動(dòng)子上游的第759個(gè)堿基[21]。有研究表明rs3102735位點(diǎn)多態(tài)性與骨鈣代謝、潰瘍性結(jié)腸炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病有關(guān)[22-24]，而與腦梗死是否具有相關(guān)性國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，LAA組中C等位基因及其對(duì)應(yīng)的CC/CT基因型的發(fā)生頻率明顯高于對(duì)照組，在調(diào)整了混雜因素(高血壓、吸煙、飲酒)以后發(fā)現(xiàn)，OPG基因rs3102735位點(diǎn)C等位基因、CC/CT基因型與腦梗死的發(fā)病可能有關(guān)。進(jìn)一步分析血漿中OPG水平與OPG基因多態(tài)性的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)攜帶C等位基因、CC/CT基因型的患者血漿中OPG水平明顯高于對(duì)照組，提示OPG基因rs3102735位點(diǎn)的C等位基因和CC/CT基因型可能與血漿OPG高表達(dá)水平有關(guān)。OPG基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)，在OPG基因啟動(dòng)子區(qū)附近的位點(diǎn)可能對(duì)OPG基因的表達(dá)造成影響。

孫菲等[1]發(fā)現(xiàn)OPG基因多態(tài)性與LAA型腦梗死有關(guān)。王猛猛等[4]研究顯示，OPG基因多態(tài)性與LAA易感性有關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)OPG基因多態(tài)性與心血管疾病、多發(fā)性骨髓瘤、骨質(zhì)疏松等多種疾病相關(guān)[25-28]。但范雪等[29]對(duì)中國(guó)遼寧地區(qū)漢族人群研究表明，OPG基因多態(tài)性與LAA易感性無(wú)顯著相關(guān)性，與本研究結(jié)果不一致，可能與研究所選人群地區(qū)差異及樣本量多少有關(guān)。

本研究顯示LAA患者血漿中OPG水平顯著增高，rs3102735位點(diǎn)C等位基因、CC/CT基因型發(fā)生頻率高，C等位基因及其對(duì)應(yīng)的CC/CT基因型患者血漿中OPG水平也增高，提示C等位基因及CC/CT基因可能與OPG水平相關(guān)，C等位基因及CC/CT基因可能通過(guò)調(diào)整LAA患者的OPG水平來(lái)增加卒中的發(fā)生。然而由于腦梗死的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，未來(lái)尚需對(duì)OPG引起LAA型腦梗死的具體機(jī)制進(jìn)行更加深入探討，為腦梗死的病因?qū)W研究以及防治策略提供科學(xué)的證據(jù)。

本研究還存在一定的局限性。首先，本實(shí)驗(yàn)只涉及到OPG單基因啟動(dòng)子區(qū)的1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，并不能代表整個(gè)基因組；其次，樣本量小，且僅限于山東漢族人群，不能排除種族及地區(qū)的差異；第三，LAA組僅選擇了LAA型腦梗死患者；第四，LAA組均為住院患者，大多數(shù)患者在入院前都進(jìn)行了降壓、降糖的治療，可能干擾了危險(xiǎn)因素對(duì)血漿OPG調(diào)節(jié)的觀察。

總之，LAA型腦梗死患者血漿中OPG水平增高，OPG基因rs3102735位點(diǎn)C等位基因及其對(duì)應(yīng)的CC/CT基因型可能與血漿高OPG水平有關(guān)。