楊杰杰 徐倩 楊玉玲 李奕璇 王彬 侯琳 李寧

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，山東 青島 266071； 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院感染科； 3 青島大學(xué)電子信息學(xué)院)

肝細(xì)胞癌(HCC)是肝臟最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤[1-2]?，F(xiàn)階段肝癌的臨床首選治療方法仍然是早期手術(shù)切除，但術(shù)后2年復(fù)發(fā)率高達(dá)55%[3-5]。近年來(lái)，大規(guī)模臨床試驗(yàn)證實(shí)靶向治療可顯著延長(zhǎng)晚期肝癌患者的生存期，靶向治療被廣泛推薦為一線(xiàn)治療方法[6-7]，但是靶向治療的副作用和耐藥性又顯著降低了其臨床效益[8-10]。因此，尋找新的有效分子靶點(diǎn)已成為HCC靶向治療研究的主要方向。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白EVA1A基因是于2007年通過(guò)高通量篩選鑒定出來(lái)的一種參與細(xì)胞程序性死亡的新基因[11-12]，定位于人類(lèi)2號(hào)染色體短臂12區(qū)(2p12)，在各種脊椎動(dòng)物中的表達(dá)高度保守。研究發(fā)現(xiàn)EVA1A過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡[13-15]。值得注意的是，與正常組織相比，EVA1A在食管鱗癌、胃腺癌、胰腺癌等人類(lèi)腫瘤組織中均有明顯的下調(diào)或不表達(dá)[16-17]，提示其可能參與了這些腫瘤的發(fā)生或進(jìn)展。目前已有研究發(fā)現(xiàn)EVA1A在人胃癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤中具有重要功能[12,18]，然而其在HCC中的功能尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究借助Huh7肝癌細(xì)胞模型過(guò)表達(dá)EVA1A，研究其對(duì)Huh7細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響，為進(jìn)一步探討EVA1A在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及尋找新的HCC治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2019年在青島大學(xué)附屬醫(yī)院確診為HCC行手術(shù)治療的患者20例，所有患者均未接受過(guò)放療或化療。于手術(shù)過(guò)程中切取HCC患者癌組織及其癌旁正常組織，所有組織樣本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為腫瘤組織和正常組織。人正常肝細(xì)胞L02與人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系Huh7來(lái)自于青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑與儀器

RIPA蛋白提取試劑盒、DAB顯色試劑盒以及MTT試劑(北京索萊寶生物科技有限公司)，小鼠抗人EVA1A單克隆抗體及小鼠抗人 GAPDH單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，熒光定量PCR試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，EVA1A、GAPDH引物 (上海生工生物工程有限公司)，Trizol RNA提取試劑盒及DAPI試劑(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.3 研究方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)HCC患者癌組織及其癌旁正常組織中EVA1AmRNA表達(dá)水平 將HCC患者癌組織和癌旁正常組織碾碎后用Trizol法提取總RNA，測(cè)定兩組RNA濃度與純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行RT-qPCR。根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，比較HCC患者癌組織和配對(duì)癌旁正常組織EVA1AmRNA的相對(duì)表達(dá)豐度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以2-△△CT表示樣本中mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.2免疫組化染色方法測(cè)定HCC患者組織中EVA1A蛋白表達(dá) 采用自動(dòng)脫水機(jī)對(duì)HCC患者癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚切片。從20例HCC患者的癌組織和癌旁正常組織樣本中隨機(jī)抽取15例，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行EVA1A免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)：①按切片中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)量的比例進(jìn)行計(jì)分：陰性計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞比例1%～10%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞比例11%～50%計(jì)2分，陽(yáng)性細(xì)胞比例51%～75%計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞比例>75%計(jì)4分。②對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的染色程度進(jìn)行計(jì)分：不著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。對(duì)兩項(xiàng)指標(biāo)計(jì)分相乘，對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行判斷：0～2分為陰性(-)，3～5分為弱陽(yáng)性(+)，6～8分為陽(yáng)性()，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.3.3Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞系中EVA1A的蛋白表達(dá)水平 分別培養(yǎng)正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞、肝細(xì)胞癌Huh7細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗滌1次，采用RIPA裂解法提取總蛋白；BCA法測(cè)定同時(shí)調(diào)整蛋白的濃度，加入5×Loading buffer以后加熱5 min使蛋白變性。然后SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)模，封閉2 h，以1∶1 000稀釋的鼠抗人EVA1A一抗4 ℃孵育過(guò)夜。以GAPDH作為內(nèi)參照蛋白，TBST洗膜以后，用對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1 h后，重復(fù)TBST洗膜步驟，ECL發(fā)光顯影，使用 ImageG-Pro Plus 6軟件分析目的蛋白條帶EVA1A和內(nèi)參蛋白條帶GAPDH的灰度值，將目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值進(jìn)行比較,得出目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值表示。

1.3.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染并檢測(cè)EVA1A過(guò)表達(dá)水平 將肝癌細(xì)胞系Huh7分成2組分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對(duì)照組轉(zhuǎn)染Myc-tag質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染EVA1A-Myc質(zhì)粒，參照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)正常轉(zhuǎn)染24 h后，采用RIPA裂解法分別裂解兩組細(xì)胞，提取蛋白，并按照1.3.3中Western blot方法進(jìn)行EVA1A蛋白表達(dá)的檢測(cè)，然后進(jìn)行條帶的灰度值分析，以相對(duì)內(nèi)參GAPDH的灰度值代表EVA1A蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果以3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值表示。

1.3.5MTT法檢測(cè)Huh7細(xì)胞的增殖能力 取轉(zhuǎn)染成功后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Huh7細(xì)胞，消化后接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔約4 000個(gè)細(xì)胞，共鋪4個(gè)板，從培養(yǎng)12 h開(kāi)始計(jì)時(shí)，每24 h任取一板采用MTT法測(cè)細(xì)胞活力，共檢測(cè)4 d。每個(gè)板在距檢測(cè)前4 h，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT試劑，4 h以后棄去培養(yǎng)基，每孔再加入DMS0 150 μL，震蕩5 min使甲瓚顆粒完全溶解，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處各孔的吸光度值，分別制作實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.6細(xì)胞劃痕法檢測(cè)Huh7細(xì)胞遷移能力 取轉(zhuǎn)染成功后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Huh7細(xì)胞，消化后接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，分別于劃痕第0、48小時(shí)時(shí)觀察細(xì)胞遷移情況并拍照，應(yīng)用ImageG-Pro Plus 6軟件計(jì)算劃痕面積，結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值。

1.3.7DAPI染色法檢測(cè)Huh7細(xì)胞的凋亡情況取轉(zhuǎn)染成功后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Huh7細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，使用PBS洗滌1次，加入適量的甲醇固定5 min。棄去固定液后用PBS洗滌1次，加入少量4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，于室溫放置5 min，吸去染色液，用PBS洗滌3次，每次3 min。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 HCC患者癌組織、癌旁正常組織中EVA1A mRNA和蛋白表達(dá)

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HCC患者癌組織和癌旁正常組織中EVA1AmRNA平均相對(duì)表達(dá)量分別為1.099±0.028、0.254±0.034，兩者比較差異具有顯著性(t=33.23，P<0.01)。免疫組化染色結(jié)果顯示，HCC患者癌旁正常組織EVA1A表達(dá)為陽(yáng)性，肝細(xì)胞呈棕黃色(圖1A)；其癌組織EVA1A表達(dá)為陰性，細(xì)胞不著色 (圖1B)。15對(duì)標(biāo)本中，HCC患者癌組織中EVA1A表達(dá)陰性14例，癌旁正常組織EVA1A的表達(dá)弱陽(yáng)性及以上13例，兩組組織中EVA1A的表達(dá)比較差異具有顯著意義(χ2=19.29，P<0.001)。

A：癌旁正常組織中EVA1A表達(dá)為陽(yáng)性，細(xì)胞呈棕褐色；B：癌組織EVA1A表達(dá)為陰性，細(xì)胞不著色

2.2 Western blot方法檢測(cè)L02以及Huh7細(xì)胞中EVA1A蛋白的表達(dá)水平

L02、Huh7細(xì)胞中EVA1A蛋白的表達(dá)水平分別為1.041±0.085、0.102±0.031，兩者比較差異具有顯著性(t=17.98，P<0.01)。

2.3 Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染EVA1A-Myc后EVA1A 蛋白的表達(dá)水平

Huh7細(xì)胞對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中EVA1A蛋白的表達(dá)水平分別為0.154±0.051、1.021±0.109，兩者比較差異具有顯著性(t=12.47，P<0.01)。

2.4 過(guò)表達(dá)EVA1A的Huh7細(xì)胞增殖能力、遷移能力及細(xì)胞凋亡的情況

MTT法檢測(cè)過(guò)表達(dá)EVA1A后Huh7細(xì)胞增殖能力顯示,時(shí)間、組別、時(shí)間與組別交互作用均對(duì)Huh7細(xì)胞增殖有顯著影響(F時(shí)間=369.41，F(xiàn)組別=260.26，F(xiàn)時(shí)間*組別=119.73，P<0.001)。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，與第1天相比，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組第2～4天Huh7細(xì)胞增殖水平明顯提高(F=19.63～388.82，P<0.01)。與對(duì)照組第3、4天相比，實(shí)驗(yàn)組第3、4天Huh7細(xì)胞的增殖水平均明顯降低(F=39.74、44.50，P<0.01)。見(jiàn)表2。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Huh7細(xì)胞劃痕愈合率分別為0.108±0.022、0.389±0.065，兩組比較差異具有顯著性(t=7.09，P<0.05)。見(jiàn)圖2。DAPI染色后，熒光顯微鏡觀察過(guò)表達(dá)EVA1A后Huh7細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中染色質(zhì)固縮、出現(xiàn)顆粒物質(zhì)以及核解體的現(xiàn)象明顯增多，其相對(duì)凋亡率為2.104±0.054，對(duì)照組為1.017±0.101，兩組比較差異有顯著性(t=-16.43，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 過(guò)表達(dá)EVA1A對(duì)Huh7細(xì)胞凋亡的影響

圖2 過(guò)表達(dá)EVA1A對(duì)Huh7細(xì)胞遷移能力的影響

表2 過(guò)表達(dá)EVA1A對(duì)Huh7細(xì)胞增殖能力的影響

3 討 論

近年來(lái)肝癌的治療手段取得了顯著進(jìn)展，但我國(guó)肝癌患者的死亡率仍高居癌癥相關(guān)死亡的第3位，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是死亡的主要原因[19-21]。研究普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡受阻是腫瘤發(fā)生的原因之一，尋找腫瘤發(fā)生中的凋亡相關(guān)基因并進(jìn)行靶向治療，已成為肝癌治療研究的新方向[22-23]。

EVA1A最早于2007年被鑒定為一種參與細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白[11]，主要表達(dá)于內(nèi)分泌組織，尤其是肝臟、胃、食管、腎上腺皮質(zhì)和垂體，提示其在這些器官中具有重要的功能。此外，EVA1A誘導(dǎo)的自噬和凋亡也在腦缺血損傷后的細(xì)胞死亡中起重要作用[24-25]。同時(shí)EVA1A介導(dǎo)的自噬在胚胎

神經(jīng)發(fā)生[26]、心臟重塑[27]、急性肝損傷[28]、內(nèi)皮角膜營(yíng)養(yǎng)不良[29]和控制乙型肝炎病毒的復(fù)制[30]中發(fā)揮重要作用，上述研究提示了其功能的多樣性和復(fù)雜性。最近發(fā)現(xiàn)EVA1A在人胃癌BGC823細(xì)胞、人骨肉瘤U2OS細(xì)胞、人食管鱗癌KYSE150細(xì)胞以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，表現(xiàn)出抑癌作用[12,18]，然而EVA1A在HCC中的表達(dá)模式、生物學(xué)功能和潛在機(jī)制尚不清楚。因此，本研究首先鑒定EVA1A在HCC中的表達(dá)情況，再進(jìn)一步研究其對(duì)HCC是否具有抑制作用。首先本研究的RT-qPCR、免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，HCC患者癌組織中EVA1AmRNA和蛋白的表達(dá)比癌旁正常組織明顯降低，提示其對(duì)HCC可能有抑制作用。Western blot檢測(cè)結(jié)果也顯示，EVA1A蛋白在人HCC細(xì)胞系Huh7中表達(dá)水平顯著低于正常肝細(xì)胞L02，與其在組織水平的表達(dá)結(jié)果一致。進(jìn)一步以人HCC細(xì)胞系Huh7為細(xì)胞模型，通過(guò)過(guò)表達(dá)EVA1A觀察細(xì)胞的生物學(xué)行為，即在肝癌細(xì)胞Huh7中過(guò)表達(dá)EVA1A模擬出正常肝細(xì)胞的EVA1A水平，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，結(jié)果顯示EVA1A過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移能力明顯下降，說(shuō)明EVA1A在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮有效的抑癌作用。為了探討EVA1A調(diào)控細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，通過(guò)DAPI染色法檢測(cè)EVA1A過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)EVA1A使Huh7細(xì)胞相對(duì)凋亡率明顯上升，提示其抑癌的作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。有研究顯示EVA1A在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87、U251、SHG44細(xì)胞系、非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞系和宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞中均顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[11,18,31]，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性，主要機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本研究與此結(jié)論相一致，提示EVA1A是一種有效的廣譜抗癌蛋白。同時(shí)本研究首次發(fā)現(xiàn)EVA1A過(guò)表達(dá)使Huh7細(xì)胞的遷移能力也有明顯下降，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)對(duì)HCC細(xì)胞的遷移和侵襲至關(guān)重要[32]，因此推測(cè)EMT可能是EVA1A參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移的作用靶點(diǎn)，但還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。關(guān)于EVA1A的抗腫瘤機(jī)制，本研究主要集中在促凋亡過(guò)程，但也不能排除EVA1A調(diào)控自噬的作用，比如在胃癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，EVA1A調(diào)控的自噬對(duì)其抑癌作用也有重要影響[18,24]，自噬是否介導(dǎo)EVA1A在肝癌中的功能也有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)EVA1A抑制了HCC細(xì)胞Huh7的增殖和遷移能力。EVA1A作為一種關(guān)鍵的抑癌蛋白，在正常肝臟中具有較高的表達(dá)水平，而在HCC中表達(dá)異常下調(diào)，可能有助于HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，是HCC發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制。未來(lái)將對(duì)EVA1A的表達(dá)與HCC患者的臨床進(jìn)展和預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)一步分析，闡明HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中EVA1A表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，為進(jìn)一步揭示HCC可能的發(fā)病機(jī)制和將來(lái)利用EVA1A為靶點(diǎn)研發(fā)HCC分子靶向藥物提供支持。