何曉燕 崔寶龍 李鵬飛 姚魯清 趙芳 周暢

(青島大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266003)

肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種選擇性作用于運動神經(jīng)元的致命性神經(jīng)退行性疾病，患者的發(fā)病年齡、發(fā)病部位、疾病進展情況以及存活時間等方面差異很大[1]。ALS的特征性病理表現(xiàn)是運動神經(jīng)元內(nèi)某些蛋白聚集，常見的有超氧化物歧化酶1(SOD1)、TAR DNA/RNA 結合蛋白43(TDP43)、肉瘤融合基因蛋白等[2]。ALS發(fā)病原因尚不清楚，但有研究顯示ALS中運動神經(jīng)元的死亡可能是非細胞自主性的，提示ALS的發(fā)病可能與非運動神經(jīng)元細胞有關[3-5]。星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含量最多的非神經(jīng)元細胞，對神經(jīng)元起著營養(yǎng)支持作用[1]。研究顯示非神經(jīng)元細胞中的星形膠質(zhì)細胞在病理狀態(tài)下，如轉(zhuǎn)染SOD1質(zhì)粒的星形膠質(zhì)細胞和正常神經(jīng)元在體外共培養(yǎng)時，能夠促進神經(jīng)元的死亡[6]。同時研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞可能與散發(fā)性ALS(sALS)有關[7]。更應引起注意的是，來源于家族性ALS(fALS)和sALS患者的星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基與神經(jīng)元共培養(yǎng)后，均能夠?qū)ι窠?jīng)元產(chǎn)生同樣的毒性作用[8]。目前的研究已經(jīng)表明，ALS運動神經(jīng)元的選擇性神經(jīng)退行性變性與星形膠質(zhì)細胞有關，但關于星形膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)毒性的潛在機制仍不是很清楚[9]。熱休克反應(HSR)是在應激狀態(tài)下誘導一組熱休克蛋白基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄的一種內(nèi)源性細胞保護機制[10]。HSR異常可能是ALS潛在的病理機制之一，但關于星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元HSR的影響及其機制還有待深入研究。神經(jīng)元在應激狀態(tài)下的HSR能夠保護細胞避免產(chǎn)生錯誤折疊蛋白，從而避免產(chǎn)生蛋白沉淀，并能夠促進錯誤折疊蛋白如TDP43的清除[11]。百草枯(PQ)是一種農(nóng)藥，能夠引起神經(jīng)細胞內(nèi)TDP43蛋白聚集，常用來制作ALS疾病模型[12]。本實驗旨在探討PQ誘導下星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)細胞內(nèi)熱休克蛋白表達以及神經(jīng)細胞存活率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y細胞系和人星形膠質(zhì)瘤細胞U87細胞系均購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清購于美國BI公司；DMEM培養(yǎng)基購于美國 Gibco公司；PQ購于美國Sigma公司；CCK8試劑購于美國MCE公司；Anti-HSF1、Anti-HSPB8、Anti-HSP70抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；內(nèi)參GAPDH和二抗均購于中國Elabscience公司。

1.2 建立細胞共培養(yǎng)體系

SH-SY5Y細胞以4.5×104/cm2的密度接種于6孔板上(下室)，U87細胞以4.5×104/cm2的密度接種于上室的聚碳酸酯膜上(孔徑0.4 μm，直徑30 mm)，上下兩室分別加入DMEM完全培養(yǎng)基分開培養(yǎng)，待細胞貼壁后，將上室U87細胞插入下室SH-SY5Y細胞中，置于含體積分數(shù)0.1胎牛血清和10 U/L青鏈霉素的DMEM中，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，模擬神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境，建立Trans-well系統(tǒng)共培養(yǎng)體系。

1.3 CCK8法檢測U87細胞和SH-SY5Y細胞存活率

U87細胞和SH-SY5Y細胞分為未經(jīng)PQ處理組(對照組)及經(jīng)100、200、300、400、500 μmol/L PQ處理組(實驗組)，以只含培養(yǎng)基組為空白組。各組培養(yǎng)在24 h后，按照1∶10的體積比加入CCK8，37 ℃孵育1 h后，酶標儀測560 nm波長處的吸光度值(A值)。細胞存活率=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。實驗重復3次，取均值。

1.4 細胞免疫熒光化學染色法檢測SH-SY5Y細胞中TDP43蛋白的定位表達情況

實驗分為空白對照組(SH-SY5Y細胞無PQ處理)、模型對照組(SH-SY5Y細胞經(jīng)300 μmol/L PQ處理24 h)。各組細胞用多聚甲醛室溫下固定15 min, 以體積分數(shù)0.005 Triton X-100室溫下通透20 min，后以體積分數(shù)0.1的山羊血清室溫下封閉30 min，然后以TDP43一抗4 ℃下孵育過夜，再以綠色熒光二抗37 ℃孵育1 h，DAPI復染核，含抗熒光淬滅劑的封片劑封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。實驗重復3次，取均值。

1.5 CCK8法檢測各組SH-SY5Y細胞存活率

實驗分為空白對照組(SH-SY5Y細胞無PQ處理)、模型對照組(SH-SY5Y細胞經(jīng)300 μmol/L PQ處理24 h)及共培養(yǎng)組(U87細胞和SH-SY5Y細胞共培養(yǎng)體系經(jīng)300 μmol/L PQ處理24 h)。CCK8法檢測各組SH-SY5Y細胞存活情況，并計算存活率。

1.6 蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測SH-SY5Y細胞中熱休克蛋白和TDP43蛋白表達

提取空白對照組、模型對照組、共培養(yǎng)組SH-SY5Y細胞總蛋白，每孔20 μg蛋白等質(zhì)量上樣，經(jīng)SDS-丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用質(zhì)量分數(shù)0.05的脫脂牛奶封閉1 h后，一抗HSF1(1∶ 1 000)、HSPB8(1∶1 000)、HSP70(1∶1 000)、TDP43(1∶1 000)、GADPH(1∶1 000)孵育過夜；二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h后，ECL發(fā)光劑顯色發(fā)光，成像分析儀檢測分析，Image J軟件分析灰度值后計算蛋白含量。實驗重復3次，取均值。

1.7 統(tǒng)計學方法

用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(AN0VA)以及LSD法進行組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 PQ對U87細胞和SH-SY5Y細胞存活率影響

實驗結果顯示，隨著PQ濃度的增加，U87細胞以及SH-SY5Y細胞的存活率均呈逐漸降低(F=9.14、37.52,P<0.01)；與對照組相比較，當PQ濃度為200 μmol/L時，SH-SY5Y細胞存活率明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05),PQ濃度為300 μmol/L 時，U87細胞的存活率明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度的PQ對SH-SY5Y和U87細胞存活率的影響

2.2 各組細胞內(nèi)TDP43蛋白的表達情況

細胞免疫熒光化學染色結果顯示，空白對照組SH-SY5Y細胞中的TDP43蛋白在細胞核內(nèi)表達，模型對照組SH-SY5Y細胞中的TDP43蛋白在細胞質(zhì)中表達(圖 1)。

箭頭所示為TDP43蛋白，免疫化學染色，100 μm

2.3 各組SH-SY5Y細胞存活率比較

空白對照組、模型對照組和共培養(yǎng)組之間的SH-SY5Y細胞存活率具有顯著性差異(F=22.69,P<0.01)；與空白對照組相比較，模型對照組SH-SY5Y細胞存活率明顯降低(P<0.01)；與模型對照組相比，共培養(yǎng)組SH-SY5Y細胞存活率也明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.4 各組SH-SY5Y細胞內(nèi)熱休克蛋白和TDP43蛋白表達水平比較

空白對照組、模型對照組和共培養(yǎng)組間細胞內(nèi)HSF1、HSP70、HSPB8和TDP43蛋白表達差異有顯著性(F=6.42～28.19,P<0.05)；與空白對照組相比較，模型對照組SH-SY5Y細胞內(nèi)的HSP70、HSPB8以及TDP43表達明顯升高(P<0.05)。與模型對照組相比較，共培養(yǎng)組SH-SY5Y細胞內(nèi)的HSF1、HSPB8表達均降低(P<0.05)。見表2。

表2 PQ對各組SH-SY5Y細胞的存活率、熱休克蛋白及TDP43蛋白表達的影響

3 討 論

研究顯示神經(jīng)元的存活會受到非神經(jīng)元細胞的影響[5]。在突變的超氧化物歧化酶1(mSOD1)轉(zhuǎn)基因嵌合體小鼠模型內(nèi)，表達mSOD1的非神經(jīng)元細胞與野生型運動神經(jīng)元共培養(yǎng)后，野生型運動神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)ALS的典型病理特征——泛素陽性的蛋白質(zhì)聚集體[13]，提示表達mSOD1的非神經(jīng)元細胞可導致運動神經(jīng)元的損傷。

星形膠質(zhì)細胞是最常見的非神經(jīng)元細胞，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)[1]。體外研究結果顯示，表達mSOD1的星形膠質(zhì)細胞和運動神經(jīng)元共培養(yǎng)時，能夠使運動神經(jīng)元的存活明顯減少[6]。并且表達mSOD1的星形膠質(zhì)細胞對運動神經(jīng)元具有選擇性毒性，但對背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元等來源的中間神經(jīng)元沒有毒性[14]。動物實驗顯示，表達mSOD1的星形膠質(zhì)細胞在大鼠體內(nèi)對運動神經(jīng)元具有毒性作用，能夠引起運動神經(jīng)元死亡，導致大鼠前肢運動功能和呼吸功能障礙[15]。來源于7例sALS患者和1例fALS患者的星形膠質(zhì)細胞與運動神經(jīng)元共培養(yǎng)后，均產(chǎn)生了同樣的運動神經(jīng)元毒性效應，提示星形膠質(zhì)細胞在ALS發(fā)病中發(fā)揮了重要作用[8]。

但BHATIA等[16]的研究結果表明，PQ處理后的星形膠質(zhì)細胞仍然能對神經(jīng)細胞產(chǎn)生保護作用。實驗中，原代神經(jīng)元經(jīng)PQ處理后與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)，并再次用PQ處理共培養(yǎng)后的2種細胞，結果顯示，PQ誘導后的星形膠質(zhì)細胞仍能促進神經(jīng)元的存活，不會失去對神經(jīng)元的保護作用。

本研究結果顯示，經(jīng)PQ處理后的星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞共培養(yǎng)后，神經(jīng)細胞的存活率明顯降低，提示PQ誘導后的星形膠質(zhì)細胞會促進神經(jīng)細胞的死亡，與 CLEMENT等[13]的研究結果一致，但與BHATIA等[16]的研究結果截然相反，可能與選擇的細胞類型不同、PQ處理的濃度不同或者實驗方法存在差異等有關，因此還需要更深入的實驗研究進行驗證。

HSR是在應激狀態(tài)下誘導熱休克蛋白表達，以維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)正常折疊的一種內(nèi)源性細胞保護機制[10]。應激狀態(tài)下的HSR能夠減少神經(jīng)元細胞內(nèi)錯誤折疊蛋白的產(chǎn)生，以及促進異常聚集蛋白的清除[17]?，F(xiàn)有研究顯示，脊髓原代細胞培養(yǎng)中，誘導HSR后，星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的HSP70明顯上調(diào)，但運動神經(jīng)元中HSP70的表達并沒有增加，提示應激狀態(tài)下的運動神經(jīng)元缺乏HSR[18]。本研究中神經(jīng)細胞經(jīng)PQ處理后熱休克蛋白表達增加，提示神經(jīng)細胞在應激狀態(tài)下能夠提高自身HSR；但將PQ誘導的神經(jīng)細胞與PQ誘導的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)后，神經(jīng)細胞內(nèi)HSF1、HSPB8的表達減少，提示PQ誘導后星形膠質(zhì)細胞會抑制神經(jīng)細胞內(nèi)熱休克蛋白的表達，對神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性作用。但PQ誘導的星形膠質(zhì)細胞抑制熱休克蛋白表達的同時，并未促進神經(jīng)細胞內(nèi)TDP43蛋白聚集增加。提示神經(jīng)細胞內(nèi)HSR異常，可能不是導致TDP43蛋白聚集的病理機制。

綜上所述，PQ誘導的星形膠質(zhì)細胞能抑制神經(jīng)細胞內(nèi)熱休克蛋白的表達，并促進細胞死亡，但對神經(jīng)細胞內(nèi)TDP43的表達無影響，提示HSR異?？赡懿皇?ALS的病理機制，仍需要進一步的實驗進行探究。