文 暢，李 梁，舒鵬程，強(qiáng)伯勤，彭小忠,2*

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心 神經(jīng)科學(xué)中心, 北京 100005;2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明 650118)

三胸家族(trithorax group proteins, TrxG)與多梳家族(polycomb group proteins, PcG)是一對(duì)進(jìn)化上高度保守，功能上相互拮抗的組蛋白修飾復(fù)合物，二者分別通過促進(jìn)組蛋白H3K4或H3K27的甲基化修飾，改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而分別激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄[1]。 TrxG復(fù)合物由WDR5、ASH2L、RBBP5和DPY30 4種核心成員、SET1A、SET1B、MLL1、MLL2、MLL3和MLL4中任意1種甲基轉(zhuǎn)移酶分子及一些輔助成員組成，TrxG各復(fù)合物通過促進(jìn)組蛋白H3K4me3修飾形成，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，便于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，進(jìn)而激活基因轉(zhuǎn)錄[2]。

DPY30通過與ASH2L發(fā)生直接相互作用，從而參與TrxG復(fù)合物形成，這種相互作用對(duì)TrxG的甲基轉(zhuǎn)移酶活性有重要的調(diào)節(jié)作用[3-5]。在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中條件性敲除DPY30與ASH2L會(huì)引起相似的表型[6-7]，并且DPY30與ASH2L均對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等具有重要作用[8-10]，但二者之間的表達(dá)相關(guān)性目前尚不明確。本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在人體各組織及K562細(xì)胞分化過程中，ASH2L與DPY30表達(dá)具有相關(guān)性，且ASH2L可能調(diào)控了DPY30蛋白水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:ASH2L條件性敲除(ASH2L-cKO)小鼠通過ASH2Lfl/fl小鼠與D6-Cre工具鼠配種所得的二代雜合子小鼠再次交配獲得，采用同窩野生型(Wild Type, WT)小鼠作為對(duì)照。ASH2L-cKO/D6-Cre小鼠可在大腦皮質(zhì)特異性敲除ASH2L基因[6]。小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體環(huán)境中，飼養(yǎng)溫度20 ℃～24 ℃，自由飲食，晝夜各12 h，所有動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)均已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)與利用委員會(huì)的批準(zhǔn)(文號(hào)：ACUC2010A02-123)，所有程序均在符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法規(guī)(中國科學(xué)技術(shù)技術(shù)委員會(huì)第2號(hào)命令)下進(jìn)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系:人慢性髓源白血病(K562)細(xì)胞系(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。

1.1.3 主要試劑:成人多組織(MTNTM)膜和Northern雜交液(Clontech公司)；探針標(biāo)記試劑盒(Promega公司)；，ASH2L抗體、MLL1抗體和MLL2抗體(Bethyl公司)；DPY30抗體和β-actin抗體(Sigma-Aldrich公司)；WDR5抗體(RDsystem公司)；RBBP5抗體(Abcam公司)； H3K4me3抗體(Millpore公司)；免疫熒光抗體辣根過氧化物酶交聯(lián)的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶交聯(lián)的山羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶交聯(lián)的兔抗山羊IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；ChIP-seq所用ASH2L和H3K4me3抗體(Active Motif公司)；Lipofectamin2000和Opti-MEM(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme公司)；熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；引物合成(北京擎科生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Nortehrn blot檢測(cè)分子表達(dá):將MTNTM膜置于6×SSC中浸濕，置于雜交管中，加入68 ℃預(yù)熱的雜交液5 mL，68 ℃預(yù)雜交30 min，棄預(yù)雜液；將32P標(biāo)記的探針(25 ng)98 ℃變性5 min，與預(yù)熱的雜交液混勻，加到雜交管內(nèi)，68 ℃雜交60 min；將雜交膜置于2×SSC,0.5% SDS 中室溫洗3次，每次10 min，于0.1×SSC,0.1% SDS中，68 ℃洗2次，每次20 min；將濕膜置于保鮮膜內(nèi)，壓X線片，-70 ℃曝光。

1.2.2 誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化:取對(duì)數(shù)增殖期的K562細(xì)胞，按(4～5)×105個(gè)/mL重懸于新配置的培養(yǎng)基中。將1 mg/mL(1.6×10-3mol/L)PMA儲(chǔ)藏液稀釋100倍，每10ml細(xì)胞懸液加稀釋后的PMA 31 μL，分別于誘導(dǎo)0.5、1、2、4和8 h后收獲細(xì)胞，Trizol法提取總RNA。

1.2.3 Western blot檢測(cè)蛋白水平:用TNTE裂解液提取小鼠大腦皮質(zhì)蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，配置適當(dāng)比例的凝膠進(jìn)行蛋白電泳，內(nèi)參蛋白β-actin抗體稀釋比例為1∶5 000，ASH2L、MLL1、MLL2和H3K4me3抗體稀釋比例為1∶1 000，WDR5和RBBP5抗體稀釋比例為1∶200，DPY30抗體稀釋比例為1∶100，辣根過氧化物酶交聯(lián)的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶交聯(lián)的山羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶交聯(lián)的兔抗山羊IgG稀釋比例均為1∶5 000。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)RNA水平:Trizol法提取總小鼠大腦皮質(zhì)總RNA，按照說明書用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，配置相應(yīng)體系進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，RT-qPCR反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性3 min，擴(kuò)增循環(huán)50次(循環(huán)條件: 95 ℃/10 s，60 ℃/30 s)，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃冷卻。根據(jù)Cq值計(jì)算各基因RNA表達(dá)水平。qPCR所用引物序列如表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.2.5 ChIP-seq分析: 本研究中ChIP-seq實(shí)驗(yàn)為取小鼠大腦皮質(zhì)，干冰凍存寄往美國Active Motif公司進(jìn)行ChIP-seq實(shí)驗(yàn)及分析后，采用IGV軟件進(jìn)行結(jié)果可視化分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同組織中DPY30與ASH2L表達(dá)分布相似

ASH2L在血液系統(tǒng)組織中表達(dá)較高，如骨髓、胎肝。DPY30與ASH2L表達(dá)分布有一定的相似性，均在骨髓、胎肝中有較高表達(dá)，同為TrxG核心成員的WDR5表達(dá)則較ASH2L和DPY30低，其與ASH2L的表達(dá)相似性較DPY30低(圖1)。

2.2 DPY30與ASH2L在PMA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化過程中表達(dá)趨勢(shì)相似

以細(xì)胞分化初始(0 h)表達(dá)量為基準(zhǔn)，DPY30與ASH2L表達(dá)均隨著K562細(xì)胞分化逐漸減少，而同為三胸家族核心成員的WDR5的表達(dá)則在分化進(jìn)行的0～1 h短暫地降低后再次升高至接近初始(0 h)水平(圖2)。

2.3 條件性敲除ASH2L導(dǎo)致DPY30蛋白減少

ASH2L-cKO小鼠大腦皮質(zhì)中，組蛋白H3K4me3修飾水平降低，DPY30蛋白減少，而其他成員蛋白含量無明顯改變(圖3A)，但條件性敲除ASH2L并未導(dǎo)致TrxG核心成員DPY30、WDR5、RBBP5的RNA水平改變(圖3B)。

A.expression of ASH2L and DPY30 in various human tissues; B.quantitative analysis of ASH2L and DPY30 in various human tissues圖1 ASH2L與DPY30在多種人體組織中表達(dá)情況Fig 1 Detection of the expression of ASH2L and DPY30 in various human

A.expression of ASH2L and DPY30 during PMA-induced K562 cells’ differentiation; B.quantitative analysis of ASH2L and DPY30 during PMA-induced K562 cells differentiation

A.protein expression of TrxG members in the cerebral cortex of ASH2L-cKO mouse; B.quantitative analysis of TrxG core components’ mRNA expression in the cerebral cortex of ASH2L-cKO mouse compared with WT mouse cortex, *P<0.05(WT:n=3, ASH2L-cKO:n=3)

2.4 H3K4me3與ASH2L在ASH2L與DPY30基因調(diào)控區(qū)域有分布

H3K4me3與ASH2L在ASH2L與DPY30基因上游調(diào)控區(qū)域均有分布，但H3K4me3在ASH2L與DPY30基因上游調(diào)控區(qū)域的結(jié)合峰度在WT和ASH2L-cKO小鼠大腦皮質(zhì)中未出現(xiàn)明顯改變(圖4，表2)。

表2 ASH2L與DPY30基因位點(diǎn)上ASH2L 與H3K4me3結(jié)合峰度分析

3 討論

TrxG通過促進(jìn)基因上游調(diào)控區(qū)域的組蛋白H3K4me3修飾，激活基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞周期調(diào)控、機(jī)體發(fā)育、腫瘤發(fā)生等眾多生命過程中發(fā)揮著十分重要的調(diào)控作用[1,2]。ASH2L與DPY30均是TrxG核心成員，ASH2L與甲基轉(zhuǎn)移酶、RBBP5、WDR5和DPY30蛋白分子均能發(fā)生相互作用，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)酶活性、輔助TrxG募集到染色質(zhì)相應(yīng)位置等功能[3-5,11]。DPY30是TrxG中最后被發(fā)現(xiàn)的核心成員[12]，在復(fù)合體中僅依靠氨基酸殘基相互作用，并且這種相互作用對(duì)H3K4me3的形成、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖分化等過程具有重要作用[3-5]。但DPY30在TrxG復(fù)合體中的具體功能目前尚不清楚。

A,B.analysis of the distribution of H3K4me3 and ASH2L on ASH2L and DPY30 loci圖4 ASH2L與DPY30基因位點(diǎn)上H3K4me3與ASH2L在分布情況分析Fig 4 Analysis of distribution of H3K4me3 and ASH2L on ASH2L and DPY30 gene loci

本研究發(fā)現(xiàn)，在不同組織及K562細(xì)胞分化過程中，DPY30與ASH2L的表達(dá)具有一定的相似性，而TrxG另一核心成員WDR5的表達(dá)則不具有這種相似性，ASH2L-cKO/D6-Cre小鼠大腦皮質(zhì)中DPY30蛋白減少，說明ASH2L可能對(duì)DPY30蛋白水平具有調(diào)控作用，缺失ASH2L蛋白會(huì)導(dǎo)致DPY30蛋白減少，而ASH2L-cKO/D6-Cre小鼠大腦皮質(zhì)中DPY30的RNA水平改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明ASH2L不是在RNA水平，可能是在蛋白水平對(duì)DPY30的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。同時(shí)ChIP-seq結(jié)果可視化分析中，H3K4me3與ASH2L在ASH2L與DPY30基因上游調(diào)控區(qū)域均有分布，但H3K4me3在ASH2L與DPY30基因上游調(diào)控區(qū)域的結(jié)合峰度在WT和ASH2L-cKO/D6-Cre小鼠大腦皮質(zhì)中未出現(xiàn)明顯改變，提示ASH2L與DPY30的轉(zhuǎn)錄可能受到TrxG所促進(jìn)的H3K4me3修飾方式調(diào)節(jié)，但這種調(diào)節(jié)并不受ASH2L表達(dá)水平的影響，從另一方面說明ASH2L不是在RNA水平對(duì)DPY30的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。然而，為什么DPY30與ASH2L表達(dá)具有相關(guān)性，ASH2L是如何調(diào)節(jié)DPY30蛋白水平的，這些問題目前尚沒有解決，需要更多的實(shí)驗(yàn)加以探究。