劉歡 李翔 劉紅佶 袁銘悅 李祥玉

青光眼是繼白內(nèi)障后的世界第二大致盲性眼病[1]，高眼壓為主要的危險(xiǎn)因素，將眼壓控制到靶眼壓范圍內(nèi)是目前青光眼的主要治療措施，可即使眼壓降至正常范圍內(nèi)，視神經(jīng)的損傷仍在繼續(xù)發(fā)展，最終致視力喪失[2]。而且，臨床上患者首次就診時(shí)，病情常常均已至中晚期、視神經(jīng)已明顯損害。因此如何保護(hù)視神經(jīng)已成為青光眼研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用烙閉上鞏膜靜脈法[3]建立SD大鼠慢性EIOP模型，觀察補(bǔ)精益視片對(duì)SD大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路MDM2、p53表達(dá)的干預(yù)作用，探討補(bǔ)精益視片對(duì)SD大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)損害的保護(hù)機(jī)制，為補(bǔ)精益視片治療青光眼視神經(jīng)損害提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

健康清潔級(jí)SD大鼠30只，8～12周齡，體重160～200g，檢查無(wú)外眼部疾病，瞳孔對(duì)光反射、眼壓正常，無(wú)歪頸,由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。補(bǔ)精益視片(批號(hào)：20170328)，購(gòu)自成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；MDM2(批號(hào)：BIO11033)、p53(批號(hào)：BIO14497)抗體試劑盒，均由 BeacomBio公司提供；復(fù)合固定液由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科提供。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 30只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和給藥組，每組10只。模型組與給藥組予烙閉大鼠右眼3支上鞏膜靜脈造模處理，對(duì)照組予暴露鞏膜上靜脈但不行烙閉處理(為假烙閉)。具體方法如下：大鼠稱(chēng)重、固定、麻醉及消毒鋪巾后，在上穹隆角膜緣剪開(kāi)球結(jié)膜180°，暴露鞏膜靜脈，用眼科手術(shù)烙閉器烙閉角鞏膜緣后3～4mm近赤道部約10、12和1鐘位的3支上鞏膜靜脈血管，烙閉后近角膜緣端的血管充盈擴(kuò)張，遠(yuǎn)角膜緣端的血管血流消失表示烙閉成功，術(shù)畢術(shù)眼涂金霉素眼膏，待大鼠蘇醒后放回籠內(nèi)，氯霉素眼液每天2次滴眼，連續(xù)1周。

1.2.2給藥方法 造模后3天給藥，對(duì)照組、模型組予3mL生理鹽水灌胃；給藥組以1.8 g·kg-1·d-1的標(biāo)準(zhǔn)(相當(dāng)于成人劑量的20倍)予補(bǔ)精益視片混懸液3ml灌胃。每天同一時(shí)間灌胃1次，連續(xù)8周。每2周稱(chēng)大鼠體重1次，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。

1.3IOP測(cè)量

用TONO-PEN眼壓計(jì)每日固定時(shí)間測(cè)量IOP。測(cè)量3組大鼠造模前、造模后即刻、造模后8周IOP。

1.4取材及固定

造模8周后以頸椎脫臼法處死大鼠，取眼球及視神經(jīng)在內(nèi)的組織塊，放置于中性甲醛液中固定72小時(shí)后，標(biāo)本采用梯度酒精脫水，石蠟包埋，選取球后2～4mm的視神經(jīng)，做常規(guī)4μm連續(xù)切片，烘干備用。

1.5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)視神經(jīng)MDM2、p53的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，過(guò)氧化氫室溫孵育10min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)浸泡5分鐘；10%的正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10min，滴加適當(dāng)比例稀釋的MDM2或p53，37℃孵育2h，PBS洗滌；滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育30min，PBS洗滌；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS洗滌；DAB顯色，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色染色。每張切片隨機(jī)取5個(gè)不同視野，用Mias-2000型圖形圖像分析儀測(cè)量視神經(jīng)MDM2和p53陽(yáng)性染色總面積及積分光密度、平均光密度的均值，作為該玻片的測(cè)量值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1IOP 情況

各組大鼠造模前、造模后即刻及造模后8周IOP情況見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)：造模前3組眼壓比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組和給藥組的造模后即刻、造模后8周均較造模前眼壓高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組造模后8周與造模后即刻眼壓比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而給藥組造模后8周較造模后即刻眼壓低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 造模前、造模后即刻及造模后8周各組大鼠眼壓值統(tǒng)計(jì)表(單位：

2.2補(bǔ)精益視片對(duì)大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路MDM2表達(dá)的影響

各組視神經(jīng)MDM2表達(dá)的總面積、積分光密度、平均光密度結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。由上可知，造模后模型組和給藥組視神經(jīng)MDM2表達(dá)均下降，兩組MDM2陽(yáng)性染色總面積、積分光密度及平均光密度較對(duì)照組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組MDM2陽(yáng)性染色總面積、積分光密度及平均光密度與給藥組相比，明顯偏低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組視神經(jīng)MDM2的表達(dá)情況

圖1 各組視神經(jīng)MDM2免疫組化陽(yáng)性染色(×400)。A：對(duì)照組; B：模型組; C：給藥組

2.3補(bǔ)精益視片對(duì)大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路p53表達(dá)的影響

各組視神經(jīng)免疫組化檢測(cè)p53表達(dá)的總面積、積分光密度、平均光密度結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。由上可知，造模后模型組和給藥組視神經(jīng)p53均上升，兩組p53陽(yáng)性染色總面積、積分光密度及平均光密度均較對(duì)照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組p53陽(yáng)性染色總面積、積分光密度及平均光密度與給藥組相比，明顯偏高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組視神經(jīng)p53的表達(dá)情況

圖2 各組視神經(jīng)p53免疫組化陽(yáng)性染色(×400)。A：對(duì)照組; B：模型組; C：給藥組

3 討論

PI3K/Akt信號(hào)通路為近年來(lái)基因調(diào)控細(xì)胞凋亡的研究熱點(diǎn)。PI3K/Akt信號(hào)通路有促進(jìn)神經(jīng)元存活的作用[4-6]。國(guó)外已有實(shí)驗(yàn)證明PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)RGCs的凋亡過(guò)程起抑制作用[7]，但具體作用機(jī)理仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的存活有著特殊的重要性。我們前期對(duì)大鼠慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中p-Akt的表達(dá)進(jìn)行了分析，證實(shí)了通過(guò)上調(diào)p-Akt的表達(dá)可修復(fù)和保護(hù)RGCs[8]。MDM2、p53亦為PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相關(guān)因子，PI3K為整個(gè)信號(hào)通路的起點(diǎn)，PI3K被激活后，激活后的產(chǎn)物與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，實(shí)現(xiàn)激活A(yù)kt，激活后的Akt使MDM2的第166位和188位絲氨酸磷酸化，增加MDM2蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)p53降解，從而對(duì)細(xì)胞發(fā)揮作用[5]。MDM2是對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有調(diào)節(jié)作用的癌基因，對(duì)細(xì)胞有增強(qiáng)生存活力、延長(zhǎng)生存期及促進(jìn)增生等作用[9]。p53是人體重要的腫瘤抑制因子，具有調(diào)控細(xì)胞DNA修復(fù)和誘導(dǎo)細(xì)胞衰老、自噬、凋亡等作用[10]。MDM2和p53在細(xì)胞內(nèi)互相制衡，MDM2抑制p53轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)p53降解；p53翻譯MDM2，激活MDM2基因轉(zhuǎn)錄，二者形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)。病理情況下，當(dāng)MDM2減少，不能降解或抑制p53轉(zhuǎn)錄活性，使p53在細(xì)胞內(nèi)的含量增加，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯或凋亡。

青光眼歸屬于中醫(yī)的“五風(fēng)內(nèi)障”，多由風(fēng)火痰虛瘀等導(dǎo)致氣血失和、氣滯血瘀、玄府閉塞、神水瘀積，日久肝腎兩虧、神光衰微甚至泯滅，不睹三光而成青盲(青光眼視神經(jīng)損害),故肝腎不足、脈絡(luò)瘀滯為青光眼視神經(jīng)損害的主要病機(jī)。補(bǔ)精益視片(原名益視片)，是中醫(yī)眼科名家陳達(dá)夫據(jù)古方“駐景丸”加減化裁而成，由菟絲子、楮實(shí)子、枸杞子、五味子、茺蔚子、車(chē)前子、丹參、三七、青皮、木瓜組成，具有滋養(yǎng)肝腎、活血通絡(luò)的功效，為補(bǔ)腎活血法的代表方?，F(xiàn)代藥理研究表明補(bǔ)精益視片中多種藥物均含各種微量元素、氨基酸等成分，能調(diào)節(jié)免疫，保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡[11]。前期研究亦證實(shí)：補(bǔ)精益視片能輕度降低眼壓[12]，保護(hù)SD大鼠慢性高眼壓模型的RGCs[13]，抑制感光細(xì)胞凋亡，修復(fù)視網(wǎng)膜和提高視力[14]等。

本研究通過(guò)觀察補(bǔ)精益視片對(duì)SD大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路MDM2、p53表達(dá)的干預(yù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)精益視片能輕度降低SD大鼠慢性EIOP模型的眼壓，上調(diào)視神經(jīng)PI3K/Akt通路凋亡抑制因子MDM2、下調(diào)凋亡促進(jìn)因子p53的表達(dá)，推測(cè)補(bǔ)精益視片保護(hù)青光眼視神經(jīng)的作用機(jī)制可能是通過(guò)降眼壓及調(diào)控PI3K/Akt通路的多個(gè)相關(guān)因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。