賈玉潔，王一，王冀邯

1.館陶縣疾病預(yù)防控制中心，河北 館陶 057750；

2.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；

3.西安交通大學(xué)附屬紅會醫(yī)院，陜西 西安 710054

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)來源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮細(xì)胞，占據(jù)腎臟惡性腫瘤首位，也是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤類型之一，且近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。腎癌相關(guān)靶向藥物有限，且其化療敏感性及預(yù)后較差，目前仍以傳統(tǒng)的根治性手術(shù)治療為主[3-4]。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對惡性疾病的預(yù)后至關(guān)重要。本研究對公共數(shù)據(jù)平臺腫瘤基因組圖譜計劃(The Cancer Genome Atlas，TCGA)[5]中腎透明細(xì)胞癌的mRNA基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析，并探索了年齡、性別、TNM分期及顯著差異表達(dá)基因?qū)颊哳A(yù)后的影響，旨在為挖掘腎癌相關(guān)的生物標(biāo)志物、探索疾病發(fā)病機(jī)制、尋找新型藥物靶點等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 選取TCGA數(shù)據(jù)庫中收錄的腎透明細(xì)胞癌RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)下載鏈接：https://gdc.xenahubs.net/download/TCGA-KIRC.htseq_counts.tsv.gz。該數(shù)據(jù)集包含了535例腫瘤樣本和72例正常對照樣本的測序數(shù)據(jù)，同時收錄了對照者及患者的年齡、性別、腫瘤TNM分期、生存時間和狀態(tài)等臨床信息。

1.2 數(shù)據(jù)處理 通過UCSC xean下載ccRCC據(jù)集(包括基因表達(dá)數(shù)據(jù)、相應(yīng)的mRNA基因名稱與ID對照數(shù)據(jù)以及樣本的臨床信息數(shù)據(jù))。運用Python語言對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，主要包括基因ID與基因名稱的匹配、基因表達(dá)數(shù)據(jù)的異常數(shù)據(jù)處理及去重計算、癌癥組與對照組的數(shù)據(jù)分離等步驟。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 運用R/Bioconductor分析獲得的基因表達(dá)原始數(shù)據(jù)[6]。在本研究中，運用R平臺(版本號：3.5.1)中的Limma算法[7]篩選腫瘤組與正常對照組間基因表達(dá)差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)大于2，P＜0.05的基因為差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)。應(yīng)用R 3.5.1中的pheatmap包對顯著差異表達(dá)的基因進(jìn)行雙聚類分析。篩選出腫瘤與正常組織中的DEGs。運用R 3.5.1中的survival包，基于患者年齡、性別、TNM、顯著高/低表達(dá)的前20個DEGs表達(dá)值繪制Kaplan-Meier生存曲線(其中計量資料以中位數(shù)為界分成高水平組和低水平組)，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床一般資料 該研究所用數(shù)據(jù)集包含401例男性，其中349例腫瘤樣本，年齡26～90歲，平均(59.36±12.10)歲；52例正常對照樣本，年齡38～90歲，平均(62.56±12.49)歲。還有206例女性，其中186例腫瘤樣本，年齡29～90歲，平均(62.90±11.81)歲；20例正常樣本，年齡41～86歲，平均(62.40±11.04)歲。在535例腫瘤樣本中，臨床TNM分期為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期者分別有269例、58例、123例、82例，另外3例樣本的TNM分期信息未知。

2.2 腎透明細(xì)胞癌差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果 運用Limma算法分析腫瘤組織與正常對照組織的mRNA基因表達(dá)譜，得到組間倍數(shù)改變大于2且P＜0.05的基因共4 837個(其中上調(diào)基因1 974個，下調(diào)基因2 863個)。選取組間倍數(shù)改變大于5、P＜0.05的基因，共得到252個差異基因(其中上調(diào)基因27個，下調(diào)基因225個，詳細(xì)基因名稱見表1)，對該252個組間差異基因進(jìn)行雙聚類分析(由于ccRCC腫瘤樣本過多，本研究隨機(jī)抽取了80例腫瘤樣本，將其與72例正常對照樣本共同聚類)?？梢钥闯?，基于組間DEGs表達(dá)情況能夠?qū)⒛[瘤樣本、正常對照樣本較好地進(jìn)行鑒別區(qū)分，見圖1。

表1 腎透明細(xì)胞癌腫瘤樣本中基因表達(dá)倍數(shù)＞5的差異表達(dá)基因匯總

2.3 影響腎透明細(xì)胞癌預(yù)后的相關(guān)因素 本研究分別將腎透明細(xì)胞癌患者的年齡、性別、TNM分期、上調(diào)/下調(diào)差異表達(dá)最顯著的前20個基因表達(dá)值(包括上調(diào)最顯著的10個差異表達(dá)基因：TNFAIP6、FABP6、HSF4、NDUFA4L2、C5orf46、NPTX2、SLC6A3、CD70、FABP7、CA9，以及下調(diào)最顯著的10個差異表達(dá)基因：UMOD、AQP2、KNG1、SLC12A1、FXYD4、CLDN8、MUC15、TMEM213、BSND、SLC9A4)為影響因素繪制生存曲線。結(jié)果如圖2所示，隨著年齡增加，患者總體生存率下降(P＜0.001)；性別差異對預(yù)后影響不大(P＞0.05)；隨著TNM分期的進(jìn)展，患者整體生存率下降(P＜0.000 1)；隨著基因NPTX2、HSF4表達(dá)升高，患者整體生存率下降(P＜0.05)；隨著基因TMEM213表達(dá)升高，患者整體生存率上升(P＜0.05)，另外的17個差異表達(dá)基因?qū)颊哒w生存率影響不顯著(P＞0.05，圖中未顯示)。

圖1 腎透明細(xì)胞癌腫瘤組織與正常對照組織差異表達(dá)基因的雙聚類分析

圖2 腎透明細(xì)胞癌患者年齡、性別、TNM分期、DEGs表達(dá)值的生存曲線分析

3 討論

ccRCC作為最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一，預(yù)后較差。尋找有效的分子標(biāo)志物對惡性疾病的早篩查、早診斷、早治療至關(guān)重要[8]。TCGA數(shù)據(jù)平臺做為目前最大的癌癥基因信息庫，擁有大規(guī)模的樣本量、豐富的組學(xué)數(shù)據(jù)以及規(guī)范的臨床數(shù)據(jù)信息，為惡性疾病相關(guān)的基因研究提供了寶貴資源。本研究分析了TCGA平臺中ccRCC的基因表達(dá)數(shù)據(jù)以及臨床信息。研究結(jié)果顯示：性別因素對患者預(yù)后影響不大，隨著年齡增加及臨床TNM分期進(jìn)展，患者整體生存率呈下降趨勢。

通過差異基因篩選，本研究得到了一系列在腎透明細(xì)胞癌中存在差異表達(dá)且具有預(yù)后研究價值的mRNA。神經(jīng)元正五聚體蛋白2(neuronal pentraxin 2，NPTX2)是神經(jīng)元正五聚體蛋白NPTXs家族成員。NPTXs是一類與C反應(yīng)蛋白和血清淀粉樣蛋白P具有同源性的蛋白家族。有研究表明NPTX2的異常表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[9-10]。林晏廷等[11]報道顯示，ccRCC腫瘤組織中NPTX2的mRNA及蛋白水平均表達(dá)升高，且其基因表達(dá)水平與TNM分期呈正相關(guān)，NPTX2高表達(dá)患者的總體生存率及無病生存率顯著降低，這與本研究得出的結(jié)果相一致。熱休克轉(zhuǎn)錄因子 4(heat shock transcription factor 4，HSF4)是熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSF家族成員。HSF在熱應(yīng)激反應(yīng)中與熱休克基因相應(yīng)的啟動子結(jié)合進(jìn)而啟動基因的轉(zhuǎn)錄過程，最終導(dǎo)致熱休克蛋白的表達(dá)[12-13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HSF4除了能啟動HSP編碼基因的轉(zhuǎn)錄過程，發(fā)揮耐受不良刺激、保持細(xì)胞完整性等重要適應(yīng)性保護(hù)作用外，亦可參與與應(yīng)激性刺激無關(guān)的過程包括細(xì)胞周期、細(xì)胞分化等生物學(xué)過程[14-15]。目前尚無報道揭示HSF4與腎癌的相關(guān)性。HSF4表達(dá)在原發(fā)性結(jié)直腸癌腫瘤組織中顯著升高，是與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的獨立影響因素[16]。JIN等[17]研究提示小鼠體內(nèi)HSF4基因失活可以誘發(fā)腫瘤細(xì)胞衰老，抑制腫瘤形成。在肝癌細(xì)胞系中，HSF4通過與靶基因相互作用，參與了細(xì)胞發(fā)育、增殖和對外部刺激應(yīng)答的生物過程，具有與核酸和蛋白質(zhì)結(jié)合及蛋白質(zhì)激活的分子功能，參與了藥物和有害異物代謝以及化學(xué)致癌的信號傳導(dǎo)通路[18]。本研究發(fā)現(xiàn)HSF4在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)升高，且隨著HSF4的高表達(dá)，患者整體生存率顯著下降(P＜0.05)，也提示該基因在疾病中可能發(fā)揮了致癌基因的作用。與此相反，基因TMEM213在ccRCC腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，且隨著其在腫瘤組織中表達(dá)升高，患者總體生存率提高，推測TMEM213在腎透明細(xì)胞癌發(fā)病中可能發(fā)揮著抑癌基因的作用。

綜上，研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中腎透明細(xì)胞癌數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，篩選出了腫瘤組織中的差異表達(dá)基因譜，并鑒定出了部分能夠影響患者預(yù)后的差異表達(dá)基因，這些基因的應(yīng)用價值及其在疾病中的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步臨床研究和基礎(chǔ)實驗的證實。研究將為腎透明細(xì)胞癌的早期分子學(xué)診斷、藥物靶點研發(fā)、疾病的發(fā)病機(jī)制分析等提供依據(jù)。